阿奇霉素膠囊2015年新版藥典微生物限度檢查法的建立及方法學驗證

游燕 杜春華 李東嫻 王鵬 鄧蘭蘭 張曉南

（云南省藥物研究所 云南 昆明 650111)

阿奇霉素為半合成的十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]。其作用機理是通過與敏感微生物的50s核糖體的亞單位結(jié)合，從而干擾其蛋白質(zhì)的合成?？咕V廣，對流感桿菌、淋球菌、化膿性鏈球菌等細菌具有顯著的抗菌效果[2]，因此對多種常見細菌感染病具有良好的抗菌作用[3]。臨床上主要用于敏感微生物所致的呼吸道、皮膚和軟組織感染。由于其抗菌療效顯著，近年來在國內(nèi)得到了廣泛應用，為使臨床用藥更加安全有效，實施微生物限度檢查是確保藥品衛(wèi)生質(zhì)量的有效途徑[4]。本文通過參考《中國藥典》2015年版四部方法建立阿奇霉素膠囊微生物限度檢查方法并進行驗證，證明采用的方法適用于相應檢測要求。

1.儀器與材料

1.1 儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號：GSP-9160MBE，上海博迅實業(yè)有限公司），生化培養(yǎng)箱（型號：LRH-150，上海一恒科學儀器有限公司），勻漿儀（型號：JT-C，漯河海德實驗設(shè)備有限公司），二級生物安全柜（型號：BSC-1100ⅡB2-X，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）

1.2 材料

HTY-反復使用全封閉薄膜過濾器、微孔濾膜（尼龍，尺寸：Φ50mm，孔徑：0.45μm），一次性泵管。

1.3 試藥阿奇霉素膠囊

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號170310；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號1706282；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號170608；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號3106032；

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號160303；麥康凱瓊液體培養(yǎng)基，批號161228；pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號1708102。（沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，其余培養(yǎng)基均來源于北京三藥科技開發(fā)公司。）

1.5 試驗菌株

銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、黑曲霉［CMCC(F)98003］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］，上述5種菌種都來源于中國食品藥品檢定研究院。

2.方法

按《中國藥典》2015年版四部通則1105、1106微生物限度檢查法規(guī)定，本品微生物限度標準為：每1g供試品中，需氧菌總數(shù)不得過103cfu，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu，大腸埃希菌不得檢出。

2.1 菌液制備

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的的制備參照新版藥典通則1105。制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10g，加入含10%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，45℃水浴至膠囊殼溶解，即得1∶10的供試液。取1∶10的供試液1ml加至9ml含10%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，即為1∶100的供試液。

3.方法適用性試驗

3.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

試驗組∶取1∶100供試液1ml，加入含0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液150ml中，混勻，用薄膜過濾法處理，每膜用水浴至45℃的含0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗700ml（每次100ml，共沖洗7次，7次沖洗中前4次使用30rpm轉(zhuǎn)速，后3次使用50rpm轉(zhuǎn)速），在第7次沖洗液中加入1ml菌落數(shù)不大于100cfu的陽性菌液，抽濾至干后取出濾膜，過濾面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行做兩個膜，倒置30～35℃培養(yǎng)3～5天。

供試品對照組：同試驗組操作，最后一次不加陽性菌。

菌液對照組：取含0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液150ml，用薄膜過濾法處理，每次100ml（每膜沖洗700ml），在最后一次的沖洗液中加入陽性菌液，其余按試驗組操作，測定菌液對照組的菌落數(shù)。

中和劑對照組：取0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1ml加入含0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液150ml，用薄膜過濾法處理，每次100ml(每膜沖洗700ml，7次沖洗中前4次使用30rpm轉(zhuǎn)速，后3次使用50rpm轉(zhuǎn)速)，在最后一次的沖洗液中加入陽性菌液，其余按試驗組操作。

陰性對照組：取含0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液700ml，用薄膜過濾法處理，每次100ml（每膜沖洗700ml），取膜過濾面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板，平行制備兩個膜，倒置于培養(yǎng)箱在30～35℃培養(yǎng)3～5天。

計數(shù)方法適用性試驗中，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在0.5～2范圍內(nèi)；中和劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應在0.5～2范圍內(nèi)。

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

試驗組：取1∶20供試液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，使其終濃度為每1ml含菌落數(shù)不大于100cfu的菌液，從試管中吸取1ml注入滅菌平皿中，立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中20～25℃培養(yǎng)72h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組的菌落數(shù)。

供試品對照組：取1∶20供試液9.9ml于滅菌試管中，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1ml，其余按試驗組操作，測定供試品對照組的菌落數(shù)。

菌液對照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，使其終濃度為每1ml不大于100cfu的菌液，其余按試驗組操作，測定菌液對照組的菌落數(shù)。

中和劑對照組：取含10%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，使其終濃度為每1ml不大于100cfu的菌液，其余按試驗組操作，測定菌液對照組的菌落數(shù)。

陰性對照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1ml至平皿中，平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基

3.3 控制菌檢查方法的驗證

試驗組：取1∶10的供試液1.25ml，加入含0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液200ml中，混勻，用薄膜過濾法處理，每膜用水浴至45℃的含0.5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗700ml（每次100ml，共沖洗7次，7次沖洗中前4次使用30rpm轉(zhuǎn)速，后3次使用50rpm轉(zhuǎn)速），在第7次沖洗液中加入1ml菌落數(shù)不大于100cfu的陽性菌液，抽濾至干后取出濾膜，放入200mlTSB中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。其余操作和結(jié)果判斷按2015版藥典通則1106進行。陰性對照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1.25mL 按大腸埃希菌檢查法操作。試驗組應檢出大腸埃希菌，陰性對照組不得檢出。試驗結(jié)果表明，大腸埃希菌檢查可采用薄膜過濾法（分8膜）。

4.結(jié)果

需氧菌總數(shù)檢查采用1∶100供試液進行薄膜過濾法，700ml沖洗液沖洗；霉菌和酵母菌檢查采用培養(yǎng)基稀釋法（1∶20供試液，1ml/皿）；大腸埃希菌采用薄膜過濾法檢查（分8膜）。采用以上方法均能消除阿奇霉素膠囊的抑菌性且需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)進行驗證試驗，藥典規(guī)定的5種陽性菌的回收比值都符合要求。

5.討論

通過參考多篇關(guān)于阿奇霉素微生物限度檢查方法的文獻[5、6]，均采用了低速離心和薄膜過濾相結(jié)合的方法來消除其抑菌作用。由于《中國藥典》2015年版在抑菌活性的去除或滅活方法方面刪除了離心沉淀法，本次研究摒棄了離心沉淀法，根據(jù)新版藥典建立阿奇霉素膠囊微生物限度檢查法，采用中和劑和薄膜過濾法相結(jié)合的方法，操作更科學合理，緩沖液用量相對減少，且能保證消除供試品的抑菌作用。

《中國藥典》2015年版提出，若試驗中使用了中和劑，那么應設(shè)立中和劑對照組，以此來確認所使用的中和劑不影響污染微生物的生長[7]。本研究中采用了0.5%吐溫80溶液作為中和劑，筆者在做試驗設(shè)計時，做了中和劑組和中和劑對照組，且二者的菌落數(shù)比值在0.5～2之間，說明0.5%吐溫80溶液不影響污染微生物的生長。

[1]國家藥典委員會.中國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]劉素霞.阿奇霉素的藥理及其臨床應用觀察[J].甘肅科技，2014，30（21）:129-130.

[3]胡掌珠，吳謹，張建，等.阿奇霉素治療感染性疾病的臨床療效評價[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2016，2（16）:276-278.

[4]達朝榮，陳建強.藥品微生物限度檢驗誤差影響因素分析[J].北方藥學，2016，13（1）:177-178.

[5]張儉儉，田志國.阿奇霉素膠囊微生物限度檢查方法研究[J].《醫(yī)藥前沿》，2011，01（19）:45-46.

[6]徐巍巍，肖利紅，姚福鑫.二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素微生物限度檢查法研究[J]煤炭與化工，2015，38（8）:1961-1963.

[7]國家藥典委員會.中國藥典分析檢測技術(shù)指南[S].中國國醫(yī)藥科技出版社，2015:568.