95%酒精固定蛋白甘油凝集法細胞塊的制備

陳楊 劉盛均

（綿陽市中心醫(yī)院病理科 四川 綿陽 621000）

細胞塊技術是將可疑病變的細胞學標本中單個細胞富集成團、固定脫水處理制作成細胞團蠟塊，進一步HE切片染色、免疫組化染色等的新技術。根據(jù)文獻報道主要方法有瓊脂包埋法、固定沉淀法、血漿凝血酶沉淀法、雞蛋清凝集法等，方法各有優(yōu)劣[1-5]。根據(jù)自身條件及臨床要求，本科室摸索出了95%酒精固定蛋白甘油凝集法細胞塊技術，該法操作簡單，成本低，效果理想，現(xiàn)介紹如下。

1.材料與方法

1.1 材料

脫落細胞學、細針穿刺細胞學等病理細胞學標本。

1.2 儀器與試劑

斜角式低速離心機，10ml離心管，2ml吸管，蛋白甘油，95%酒精。

1.3 方法

1.3.1 蛋白甘油制備：取新鮮雞蛋的蛋清至于燒杯中。按7：3比例加入甘油，以玻璃棒充分混勻，攪拌至均勻泡沫狀，放置于冰箱冷藏室過夜。去除表面凝結浮沫，收集下部澄清液于200ml滴管瓶，置于4～8攝氏度冰箱保存。每100ml可加入0.5g麝香草酚以防腐。

1.3.2 液基細胞學制片后剩余的細胞學標本，靜置2小時后，傾去多余上清液，留10～20ml標本液，震蕩混勻，將細胞懸液移至10ml離心管，2500r/min離心5min。

1.3.3 緩慢傾去上清液，加入2ml的95%酒精，若細胞沉淀較少則加入2滴蛋白甘油，用吸管吹打混勻后完全吸入吸管，倒立使細胞懸液完全收集于吸管頭，編號后剪去吸管尖多余部分，放入離心機4000r/min，離心10min。

1.3.4 棄去上清，剪刀剪去吸管頭，輕輕倒出細胞塊于濾紙中，包裹后放入已編號組織包埋盒，與活體病理檢查組織同放于全自動病理組織脫水機中，進行后續(xù)處理。

1.3.5 常規(guī)包埋、切片、HE染色、診斷。根據(jù)診斷需要，進行特殊染色、免疫組化、分子病理等檢測。

2.結果

細胞塊完整，不易破碎，可多次重復切片；HE染色鏡下細胞富集，有效成分多，核漿分明；免疫組化染色結果定位準確，易于判讀；可進行FISH、PCR、重排、測序等分子病理檢測。

3.討論與體會

3.1 操作要點

純雞蛋清太過粘稠，不易吸取，且離心后容易與沉淀物分層；本科室采用甘油，按照蛋清、甘油7:3的比例混勻制成蛋白甘油使用，稀釋度合理，離心后細胞團塊堅實，不易散。

該方法的原理是95%酒精使蛋白變性凝固作為基質對分散的單個細胞進行包裹，胸膜腔積液等含蛋白較多的體液標本，初次離心后可留1ml上清液不必傾去，加入95%酒精可使蛋白析出，再次離心后形成自體蛋白基質；如細胞團小則同時加入蛋白甘油作為基質。尿液、腦脊液、細胞穿刺液等細胞量較少，應加入蛋白甘油作為基質，才能制作出較完整的細胞塊。

為了使蛋白質充分變性形成蛋白基質網絡細胞，在標本中加入95%酒精和蛋白甘油后，必須用吸管反復吹打混勻。

血性標本液，需在初次離心沉淀后，加入細胞清潔液，充分震蕩后再次離心，去除紅細胞后再按照上述方法制作細胞塊。

3.2 技術缺陷

對于漿膜腔積液，特別是臨床懷疑惡性腫瘤患者的漿膜腔積液，陽性檢出率高，效果顯著；但是對于尿液、腦脊液等細胞較少的體液標本，做出的細胞塊有效成分較少，僅作為輔助運用；

部分細胞塊進行免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)背景較深，估計與自體蛋白有關，后續(xù)將進行相關工作的研究。

3.3 技術優(yōu)勢

細胞學病理檢查，是通過有創(chuàng)或微創(chuàng)的方法，采集人體可疑病變部位的細胞及組織碎片，經病理細胞學技術員制片，病理醫(yī)師顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，進行疾病診斷的病理學方法之一。與活體組織檢查相比，具有創(chuàng)傷小、標本易獲得、報告時限短等優(yōu)點。但在診斷陽性率、準確性方面，與活體組織檢查有一定差距，以及無法進行特殊染色、免疫組化、分子病理等進一步檢測與診斷，限制了病理細胞學的發(fā)展。我科開展的蛋白甘油凝集法細胞塊制作技術，將有可疑病變的細胞學標本制作成細胞塊，固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后，作出的蠟塊具有能多次切片、易于長期保存，可進行特殊染色、免疫組化和分子病理診斷等優(yōu)點，提高細胞學診斷的陽性率，是對細胞學診斷有力的補充和擴展。

對于文獻報道的瓊脂包埋法、固定沉淀法、血漿凝血酶沉淀法、雞蛋清凝集法等[1-4]。瓊脂包埋法較復雜，瓊脂不易得且需要加熱溶解，其對脫水影響也很大，現(xiàn)已很少使用；血漿凝固酶難以采購；固定沉淀法作出的細胞塊易碎不堅固，對于細胞很少的體液難以成功，縮小的細胞塊可用范圍。經反復實驗總結，95%酒精固定蛋白甘油凝集法成功率高適用于所有送檢體液標本、且操作簡單，穩(wěn)定興高，材料易得，成本低廉，得到的細胞塊較堅實完整、脫水處理佳，HE染色紅藍對比分明、免疫組化染色結果清楚。

本科室從2013年至今用此方法制作了細胞塊4000余例，免疫組化染色1300余例，證實該方法切實可行，可在各級醫(yī)院病理科開展。