RAPD分子標(biāo)記對(duì)工業(yè)大麻誘變材料的分析

姜 穎，張麗娜，潘冬梅，韓承偉，王曉楠，曹 焜，韓喜財(cái)，孫宇峰

（1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

大麻（Cannabis sativaL.）為大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（CannabisL.）一年生草本植物［1-2］，在我國已有 5 000多年的栽培利用歷史，是我國傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物，具有重要的工業(yè)及藥用價(jià)值［3-4］。采用歐盟的劃分標(biāo)準(zhǔn)即THC＜0.3%為無毒大麻即工業(yè)大麻，世界各國都只允許種植工業(yè)大麻。大麻的產(chǎn)品利用涉及紡織、服裝、造紙、軍需、化工、建材、生物能源、食品及制藥等多個(gè)方面［5-9］。因此，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高纖、低毒的工業(yè)大麻新品種尤為重要。

誘變育種是利用物理或化學(xué)的誘變劑處理植物材料如種子、植物或其他器官，使其遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，產(chǎn)生各種突變，然后在發(fā)生突變的個(gè)體中選擇符合人們需要的植株進(jìn)行培育，從而獲得新品種。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）具有操作簡(jiǎn)便、不需提前知道材料基因信息、檢測(cè)靈敏、多態(tài)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前研究植物種群遺傳變異、種質(zhì)資源評(píng)估、栽培植物品種鑒定等方面廣泛采用的一種分子標(biāo)記法［10］。RAPD技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于作物育種、分子生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、植物抗病性以及植物質(zhì)量性狀的標(biāo)記等研究領(lǐng)域。鑒于此，本研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)EMS化學(xué)誘變和Co60-γ射線物理誘變進(jìn)行變異分析，為工業(yè)大麻突變產(chǎn)生提供充分的分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)誘變材料的創(chuàng)建與選擇

試驗(yàn)于2015年4月28日至2016年9月24日在黑龍江省大慶市東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。用pH 7.5、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液和二甲基亞砜（DMSO）配制EMS，設(shè)0、0.4%、0.8%、1.25%、2.0% 5個(gè)EMS濃度，對(duì)火麻一號(hào)工業(yè)大麻種子分別浸種處理6 h后，用0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液沖洗5次，每次靜置5 min以終止反應(yīng)［5］。然后播種，行距0.30 m，株距0.03 m，田間管理按一般試驗(yàn)田進(jìn)行，按單株收獲。將收獲的M1代種子第二年繼續(xù)播種，小區(qū)面積為2.0 m×2.0 m，采用單粒點(diǎn)播，行距0.30 m，株距0.06 m。田間管理按一般試驗(yàn)田進(jìn)行，適時(shí)收獲M2代種子。

1.2 物理誘變材料的創(chuàng)建與選擇

利用Co60-γ射線對(duì)五常40、農(nóng)安2、火麻一號(hào)、格里昂、格里西亞5個(gè)工業(yè)大麻干種子進(jìn)行處理，設(shè)5個(gè)劑量，分別為0、50、100、150、200 Gy，劑量率為0.10 Gy/min。處理后的種子直接播種于溫室，田間管理按一般試驗(yàn)田進(jìn)行，適時(shí)收獲M1代種子。

1.3 RAPD分子標(biāo)記鑒定

將收獲的工業(yè)大麻種子整齊排列在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，24℃恒溫、光下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，一段時(shí)間后取葉片樣品，液氮中速凍，存于-80℃待用。取100 mg樣品經(jīng)液氮研磨后，用ProbeGene公司的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，最后溶于100 μL洗脫緩沖液EB中備用。

RAPD分子標(biāo)記反應(yīng)體系：ddH2O 8.0 μL，2×Taq Master Mix 10.0 μL，DNA 1.0 μL，Primer 1.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 1 min、復(fù)性36℃ 1 min、延伸72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；再延伸72℃ 5 min，4℃保存。所選引物［11］如表1所示。

表1 大麻RAPD分析適宜的引物及核苷酸序列（5′-3′）

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Gel-Pro analyzer軟件對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)換成“0”和“1”；然后利用NTSYSpc（W）軟件和SLT_NTsys_2.10e軟件結(jié)合，進(jìn)行樹狀圖的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

由于大麻含酚類化合物較多（目前已報(bào)道的有61種），在DNA的提取過程中極容易被氧化［12］，本試驗(yàn)利用DNA提取試劑盒可獲得純度較高的DNA樣品（圖1），RAPD分析標(biāo)記以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

圖1 誘變材料葉片中提取的DNA

2.2 化學(xué)誘變材料的RAPD分析

選擇24株EMS誘變材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，引物OPV-08擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。對(duì)11個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建樹狀圖，從圖3可以得出，與對(duì)照相比基因差異性最大的為c19、c20、c23，其EMS誘變濃度為2%。

圖2 引物OPV-08擴(kuò)增結(jié)果

2.3 物理誘變材料的RAPD分析

2.3.1 農(nóng)安2 選擇19株物理誘變的農(nóng)安2材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，引物OPI-07擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。對(duì)11個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖5）可以得出，與對(duì)照相比基因差異性較大的為c13、c14、 c18、c19，其誘變劑量在150～200 Gy之間。

圖3 火麻一號(hào)化學(xué)誘變樹狀圖

圖4 引物OPI-07擴(kuò)增結(jié)果

圖5 農(nóng)安2物理誘變樹狀圖

2.3.2 火麻一號(hào) 選擇29株物理誘變的火麻一號(hào)材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，引物OPP-12擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。對(duì)11個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖7）可以得出，與對(duì)照相比基因差異性較大的為c14、c15、c19、c20，其誘變劑量在100～150 Gy之間。

圖6 引物OPP-12擴(kuò)增結(jié)果

圖7 火麻一號(hào)物理誘變樹狀圖

2.3.3 五常40 選擇13株物理誘變的五常40材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，引物OPU-12擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示。對(duì)11個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖9）可以得出，與對(duì)照相比基因差異性較大的為c10、c11、 c12、c13，其誘變劑量為150 Gy和200 Gy。

圖8 引物OPU-12擴(kuò)增結(jié)果

圖9 五常40物理誘變樹狀圖

2.3.4 格里昂 選擇11株物理誘變的格里昂材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，引物OPZ-13擴(kuò)增結(jié)果如圖10所示。對(duì)11個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖11）可以得出，與對(duì)照相比基因差異性較大的為c7、c8、c9，其誘變劑量在150～200 Gy之間。

圖10 引物OPZ-13擴(kuò)增結(jié)果

圖11 格里昂物理誘變樹狀圖

2.3.5 格里西亞 選擇12株物理誘變的格里西亞材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，引物OPY-11擴(kuò)增結(jié)果如圖12所示。對(duì)11個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖13）可以得出，與對(duì)照相比基因差異性較大的為c8、c12，其誘變劑量在150～200 Gy之間。

圖12 引物OPY-11擴(kuò)增結(jié)果

2.3.6 金刀15 選擇33株物理誘變的金刀15材料進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，引物OPX-13擴(kuò)增結(jié)果如圖14所示。對(duì)11個(gè)引物擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建樹狀圖，從結(jié)果（圖15）可以得出，與對(duì)照相比基因差異性較大的為c18、 c20，其誘變劑量為100～150 Gy。

圖13 格里西亞物理誘變樹狀圖

圖14 引物OPX-13擴(kuò)增結(jié)果

圖15 金刀15物理誘變樹狀圖

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在2%EMS誘變處理工業(yè)大麻種子6 h時(shí)，后代發(fā)生的突變率最高。Co60-γ射線誘變后，農(nóng)安2、五常40、格里昂、格里希亞的誘變材料與對(duì)照基因差異性較大的處理劑量在150～200 Gy之間；火麻一號(hào)的誘變材料與對(duì)照相比基因差異性較大的為c14、c15、c19、c20，其誘變劑量在100～150 Gy之間；而金刀15的誘變材料與對(duì)照相比基因差異性較大誘變劑量為100～150 Gy之間。與對(duì)照差異顯著的誘變材料，其誘變濃度或劑量與之前篩選的適宜誘變濃度或劑量相近。化學(xué)誘變濃度是2.0%，處理6 h［5］；Co60-γ誘變劑量基本都在150 Gy左右［13］，所以筆者認(rèn)為RAPD分子標(biāo)記也可以作為誘變濃度或劑量的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

［1］王殿奎，關(guān)鳳芝.黑龍江省大麻生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策［J］.中國麻業(yè)，2005，27（2）：98-101.

［2］吳廣文.黑龍江省大麻發(fā)展問題和建議［J］.中國麻業(yè)科學(xué)，2007，29（6）：356 -357，370.

［3］熊和平主編.麻類作物育種學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008：297.

［4］Allegret S，Bouloc P，Arnaud L，et al.Hemp：Industrial Production and Uses［M］.Bouloc（Ed.），2013：4-26.

［5］姜穎.EMS對(duì)工業(yè)大麻種子萌發(fā)的影響［J］.中國麻業(yè)科學(xué)，2016，38（6）：258-262.

［6］姜穎，韓承偉，李秋芝，等.工業(yè)大麻籽的開發(fā)利用［J］.黑龍江科學(xué)，2014，5（2）：6-7.

［7］Radu S，Robu T.Effects and efficiency of dietary hemp seed and flaxseed oils on the human metabolic function［J］.Journal of Environmental Protection and Ecology，2014，15（1）：326-331.

［8］Delfin R L，Grant N P.The cardiac and haemostatic effects of dietary hempseed［J］.Nutrition & Metabolism，2010，7：32.

［9］Lee M J，Park M S，Hwang S J，et al.Dietary hempseed meal intake increases body growth and shortens the larval stage via the upregulation of cell growth and sterol levels inDrosophila melanogaster［J］.Molecules and Cells，2010，30（1）：29-36.

［10］沈浩，劉登義.遺傳多樣性概述［J］.生物學(xué)雜志，2001，18（3）：4-7.

［11］蘇友波，朱穎，林春，等.大麻RAPD分子標(biāo)記的引物篩選［J］.中國麻業(yè)科學(xué)，2002，24（5）：12-16.

［12］陳其本，余立惠，楊明，等.大麻栽培利用及發(fā)展對(duì)策［M］.成都：電子科技大學(xué)出版社，1993：294-308.

［13］姜穎，孫宇峰，潘冬梅，等.Co60-γ射線輻照對(duì)工業(yè)大麻種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2017，37（15）：5-7.