NO對低溫脅迫下草地早熟禾抗氧化系統的調控

陳潤娟，雷婭偉，白小明，袁承華，田彥鋒

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

白小明為通訊作者。

溫度作為植物生長發育的主要環境因子之一，參與植物的新陳代謝、蒸騰作用、礦質元素吸收，以及所有的酶促反應、休眠和生長發育[1]。溫度過低對植物的傷害是一個世界性的問題，也是農業、林業以及畜牧業生產的重要環境限制因子。在草坪產業中，低溫脅迫不僅影響草坪的綠期和質量，嚴重時還能使草坪草植株死亡，導致建坪失敗。在我國北方，大部分地區冬季寒冷干旱，草坪草的安全越冬受到威脅，而春秋兩季氣溫不穩定，寒流侵襲又使草坪經常出現春季返青晚、秋季早衰的現象，致使草坪生長不良，甚至嚴重退化，影響草坪的整體美觀，降低草坪的綠期和使用價值[2]。提高草坪草耐寒性的方法一是選育耐寒品種，二是通過施加外源物質來提高其抗性。一氧化氮(NO)作為一種脂溶性和微水溶性小分子氣體，過去一直被認為是有毒分子，直到1998年，諾貝爾生理學醫學獎授予了在動物NO信號轉導途徑方面做出突出貢獻的3位科學家，此后人們逐漸發現作為一個非傳統的重要信號分子[3]，NO廣泛參與了植物體內多種生理過程的調節，尤其在逆境條件下，其作用更為顯著[4-6]。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為采自甘肅定西市安定區的野生草地早熟禾，采集地生境為山坡，海拔2 490 m，地理坐標N 35°20.41′，E 104°05.26′。

1.2 試驗設計

試驗中以亞硝基鐵氰化鈉(SNP，Sigama公司，分

析純)為NO供體(產生NO)，亞鐵氰化鈉(sodium ferrocyanide，縮寫為SF)為SNP類似物(不產生NO)，牛血紅蛋白(Hb)為NO清除劑，鎢酸鹽(tungstate，縮寫為T)為硝酸還原酶活性抑制劑，N-硝基-L-精氨酸甲脂(NG-nitro-L-Arg-methyl ester，L-NAME)為一氧化氮合酶抑制劑，以上化學試劑均購于Sigma 公司。試驗設13個處理(表1)。

表1 試驗處理

供試材料幼苗培育采用盆栽沙培方式，花盆直徑11 cm，深11 cm。幼苗生長3個月后選取長勢整齊一致，無病蟲害的幼苗修剪至8 cm，進行處理。各處理液用量為80 mL,用噴霧器噴施于供試材料葉面，用塑料薄膜覆蓋植株在20℃培養箱保濕2 h。連續噴施3 d,1次/d,第4 d將經過處理的材料從培養箱中取出,在4℃智能型光照培養箱(SPX-300-GB，上海躍進醫療器械有限公司，中國)進行低溫脅迫6 d(處理的第0、2、4、6 d進行澆灌)，20℃為對照。每個處理4盆，重復4次，6 d 后取生長一致的幼苗測定相關生理生化指標。

1.3 測定指標與方法

(1)丙二醛(MDA)含量測定 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[14]。

過氧化氫(H2O2)含量，參照文獻[16]的方法進行。

羥自由基(·OH)含量，參照文獻[17]的方法進行。

(3) 抗氧化物酶活性 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照文獻[18]的方法測定。

過氧化物酶(POD)活性，參照文獻[19]的方法測定。

過氧化氫酶(CAT)活性，參照文獻[20]的方法測定。

抗壞血酸氧化物酶(APX)活性，參照文獻[21]的方法測定。

谷胱甘肽還原酶(GR)活性，參照文獻[22]的方法測定。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0進行方差分析和顯著性檢驗，Excel制作圖表。

2 結果與分析

2.1 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA含量的影響

4℃低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA含量顯著高于CK(P<0.05)，是CK的1.68倍，說明低溫脅迫促進了葉片膜脂過氧化產物MDA的積累。施入SNP后MDA含量明顯降低(P<0.05)，比4℃處理下降25.07%。低溫脅迫下施用牛血紅蛋白、鎢酸鈉和L-NAME，葉片MDA含量顯著升高(P<0.05)，分別比4℃處理提高27.82%，23.19%和23.87%，添加SNP后膜脂過氧化程度降低，MDA含量均下降到了4℃處理水平，分別為14.00，13.83和13.57 μmol/g。亞鐵氰化鈉處理下草地早熟禾葉片MDA含量為14.54 μmol/g，與4℃處理無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA的影響Fig.1 Effect of nitric oxide on malondialdehyde content in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.2 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片自由基的影響

圖2 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片H2O2、·OH含量及產生速率的影響Fig.2 Effect of nitric oxide on the content of H2O2 and OH- and · emission rate in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress

2.3 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、APX和GR等抗氧化酶是植物體ROS清除系統的重要組成部分，許多研究表明，低溫能引起氧化脅迫并且改變抗氧化酶的活性，NO能調控抗氧化酶活性，緩解氧化脅迫的傷害。低溫脅迫下草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性顯著增強，分別比CK提高了39.59%、69.26%、106.43%、71.15%，施入SNP后SOD、POD、APX和GR活性進一步的升高(P<0.05)，分別比4℃低溫脅迫提高了31.87%、38.54%、64.66%、113.19%；低溫脅迫下牛血紅蛋白、鎢酸鈉和L-NAME處理則抑制了草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性，再添加SNP則抑制作用被緩解，SOD、POD、APX和GR活性又增強。低溫脅迫下亞鐵氰化鈉處理草地早熟禾葉片中SOD、POD、APX和GR活性與CK相比則顯著提高，增幅分別37.55%、70.68%、122.62%、83.86%，與對應的4℃低溫處理無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of nitric oxide on antioxidant enzymes activity in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress

3 討論

NO作為植物中廣泛存在的一種正常代謝物和重要的信使分子,與非生物脅迫下植物體內ROS代謝的調控有關，可以緩解各種脅迫造成的氧化損傷，增強植物的適應能力[28]。劉開力等[29]報道，外源NO可通過提高水稻(Oryzasativa)幼苗根組織的抗氧化能力來緩解鹽脅迫下的氧化損傷。馬向麗等[30]研究證實，外源NO處理能顯著提高SOD，CAT和POD三者的活性，從而增強一年生黑麥草的抗冷性。本研究表明，SNP處理提高了草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性，增強了低溫脅迫下清除活性氧的能力，由于保護酶活性上升，清除有害自由基，MDA的生成減少，膜系統受到保護；另一方面，MDA的減少可能使保護酶的活性上升，增強膜系統保護酶的功能，兩者相輔相成。

亞鐵氰化鈉是SNP的類似物，在生物體中分解后除不產生NO外，其他的產物與SNP相同[31]。低溫脅迫下亞鐵氰化鈉處理草地早熟禾對MDA、自由基和抗氧化酶活性均無明顯影響，進一步說明緩解低溫脅迫下草地早熟禾氧化損傷作用的物質是NO，這與周萬海等[32]在苜蓿鹽脅迫上的研究結果類似。

4 結論

[1] 王代軍,溫洋.溫度脅迫下幾種冷季型草坪草抗性機制的研究[J].草業學報,1998,7(1):75-80.

[2] 梁慧敏,夏陽,杜峰，等.低溫脅迫對草地早熟禾抗性生理生化指標的影響[J].草地學報,2001,9(4):283-286.

[3] F rstermann U,Sessa W C.Nitric oxide synthases:regula-tion and function[J].Eur Heart J,2012,33(7):829-837.

[4] Zhang W L,Shen W B,Xu L L.Effect of nitric oxide on thesingalmolecularity[J].Chemistry of Life,2002,22:61-62.

[5] Durner J,Klessig D F.Nitric oxide as a signal in plants[J].Curr Opin Plant Biol,1999(2):369-374.

[6] Garcia M C,Lamattina L.Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress[J].Plant Physiol,2001,126:1196-1204.

[7] Zhao L，He J X，Wang X M，etal．Nitric oxide protectsagainst polyethylene glycol-induced oxidative damage in two ecotypes of reed suspension cultures[J]．Journal of Plant Physiology，2008，165:182-191.

[8] Beligni M V，Lamattina L．Nitric oxide protects against cellular damage produced by methylviologen herbicides in potato plants[J]．Nitric Oxide，1999，3(3):199-208.

[9] Song L L，Ding W，Zhao M G，etal．Nitric oxide protects against oxidative stress under heat stress in the calluses from two ecotypes of reed[J]．Plant Science，2006，171:449-458.

[10] 楊美森,王雅芳,干秀霞,等.外源一氧化氮對冷害脅迫下棉花幼苗生長、抗氧化系統和光合特性的影響[J].中國農業科學，2012(15)：3058-3067.

[11] 徐洪雷,于廣建.一氧化氮(NO)對黃瓜低溫脅迫的緩解作用[J].東北農業大學學報,2007,38(5):606-608.

[12] 陳宇,林素英,黃志明,等.枇杷幼果內源一氧化氮和茉莉酸對低溫脅迫的響應[J].植物科學學報,2012,30(6):611-617.

[13] 魯存海,白小明.8種野生早熟禾種質材料坪用特性和草坪質量評價研究[J].草原與草坪,2011(5):55-59.

[14] 鄒琦.植物生理學試驗指導[M].北京:中國農業出版社,2000.

[15] 陳建勛,王曉峰.植物生理學實驗指導[M].廣州:華南理工大學出版社,2002:119-127.

[16] Velikova V,Yordanov I,Edreva A.Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain -treated bean plants[J].Plant Science,2000(151):59-66.

[17] Halliwell B,Grootveld M,Cutteridge J M C.Methods for the measurement of hydroxyl radicals in biochemical systems:deoxyribose degradation and aromatic hydroxylation[J].Methods Biochem Anal,1988,33:59-90.

[18] Giannopolitis C N,Ries S K.Superoxide dismutases.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiology,1977,59:309-314.

[19] Urbanek H,Kuzniak-Gebarowaka E,Herka.Elicatation of defense responses in bean leaves by Botrytis cinereapolygalac-turonase[J].Acta Physiologic Plant arum,1991,13:43-50.

[20] Beers Jr R F,Sizer I W.A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase[J].Journal of Biological Chemistry,1952,195:133-140.

[21] Nakano Y,Asada K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts[J].Plant and Cell Physiology,2015,22:867-880.

[22] Foyer C H,Halliwell B.The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts:A proposed role on ascorbic acidmetabolism[J].Planta,2016,133:21-25.

[23] 孫宗玖,阿不來提,齊曼.狗牙根新品種抗寒性評價及生理基礎的研究[J].中國草地,2003,25(4):25-30.

[24] Sharma P，Sharma N，Deswal R．The molecular biology of the low temperature response in plants[J]．Bioessays，2005，27(10):1048-1059.

[25] 杜永吉,于磊,孫吉雄,等.結縷草品種抗寒性和抗寒機理研究[J].草地學報,2008,16(17).

[26] 樊懷福，郭世榮，焦彥生，等．外源一氧化氮對NaCl脅迫下黃瓜幼苗生長、活性氧代謝和光合特性的影響[J]．生態學報，2007，27(2):546 -553.

[27] 蔡志全，曹坤芳，馮玉龍，等.夜間低溫脅迫對兩種生長光強下藤黃幼苗葉片熒光特征和活性氧代謝的影響[J].應用生態學報，2003,14(3)：326-331.

[28] Arasimowicz M,Floryszak-W ieczorek J.Nitric oxide as a bioactive signalling molecule in plant stress responses[J].Plant Science,172:876-887.

[29] 劉開力，韓航如，徐穎潔，等.外源一氧化氮對鹽脅迫下水稻根部脂質過氧化的緩解作用[J].中國水稻科學，2005，19(4):333-337.

[30] 馬向麗，魏小紅，龍瑞軍，等.外源一氧化氮提高一年生黑麥草抗冷性機制[J].生態學報，2005，25(6):1269-1274.

[31] Shi Q H，Ding F，Wang X F，Wei M． Exogenous nitric oxide protect cucumber roots against oxidative stress induced by salt stress[J]． Plant Physiology and Biochemistry，2007，45:542-550.

[32] 周萬海,馮瑞章,師尚禮,等.NO對鹽脅迫下苜蓿根系生長抑制及氧化損傷的緩解效應[J].生態學報，2015，35(11):3606-3614.

[33] Liu Y J，Jiang H F，Zhao Z G，etal． Nitric oxide synthase like activity-dependent nitric oxide production protects against chilling-induced oxidative damage in Chorisporabungeana suspension cultured cells[J]．Plant Physiology and Biochemistry，2010，48:936-944.

[34] Liu Y G，Wu R R，Wan Q，etal．Glucose-6-phosphate dehydrogenase plays a pivotal role in nitric oxide-involved defense against oxidative stress under salt stress in red kidney bean roots[J].Plant and Cell Physiology，2007，48:511-522.

[35] Wang H H，Huang J J，Bi Y R．Nitrate reductase-dependent nitric oxide production is nvolved in aluminum tolerance in red kidney bean roots[J].Plant Science，2010，179:281-288.