觀賞海棠生理生化指標對低溫脅迫的響應

郭芳蕓，蔣 倩，楊永花，孫 璐，周 銘，劉成富

(1.甘肅農業大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州市園林科學研究所，甘肅 蘭州 730070)

蔣倩為通訊作者。

觀賞海棠(Malusspp.)為薔薇科蘋果屬灌木或小喬木，是中國的傳統名花之一，其姿態瀟灑，花開似錦，具有適應性強，耐寒、耐旱的特性，常作為城市綠化、美化的觀賞花木，在園林植物造景配置中可叢植或群植，觀賞價值極高，綠化效果出眾，應用范圍極為廣泛[1]。

觀賞海棠的抗寒性研究已有報道[2]，韓玲玲等[3]對內蒙古包頭市引種的紅寶石、珍珠、亞當、西府海棠、鉆石等觀賞海棠的抗寒性研究表明，抗寒性強弱依次為紅寶石>珍珠>亞當>西府海棠>鉆石；李萍萍[4]對山東省15個觀賞海棠品種的抗寒性研究顯示，各品種的抗寒性強弱有較大差異。蘭州地處西北內陸，冬季漫長且較寒冷，雨雪少，因此，低溫凍害是影響園林植物生長與分布的重要因素之一[5]。為此，通過對凱爾斯、雪球、火焰、草莓果凍、紅麗、絢麗6種觀賞海棠在不同低溫脅迫下的電導率、可溶性糖、脯氨酸等相關生理指標的測定，運用綜合評價方法，研究其在蘭州地區的抗寒性表現，旨在為選用本地耐寒性觀賞海棠品種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為蘭州市園林科研所提供的6個觀賞海棠品種凱爾斯(Kelsey)、雪球(Snowdrift)、火焰(Flame)、草莓果凍(Strawberry Parfait)、紅麗(Red Splendor)、絢麗(Radiant)的一年生枝條。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣和材料處理 選取栽培管理條件基本相同的6個觀賞海棠品種一年生枝條，各品種按照對角線法選取長勢相近的5株，從每株上隨機采5條一年生枝條，要求枝條充分成熟，粗度相近，整齊均勻，從枝條基部第3個芽處剪留長度為10 cm枝條,供試枝條先用自來水和去離子水洗滌晾干后，將任意選取的6個觀賞海棠枝條用塑料薄膜紙裝袋，置于超低溫冰箱中進行人工冷凍脅迫，脅迫溫度分別為0、-5、-10、-15、-20及-25℃，每級溫度處理10 h，將冷凍過的枝條置于4℃冰箱解凍2.5 h取出，進行各項指標的測定，每個品種的每種處理重復測3次。

1.2.2 指標測定 6個觀賞海棠品種的耐寒性指標測定，電導率采用雷磁電導儀測定[6]，計算電解質滲出率及半致死溫度，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[6]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[6]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[6]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT顯色法測定[7]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定[7]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定[7]。

1.2.3 半致死溫度確定 將所測得的相對電導率與處理溫度配合成logistic方程[8]，求出該曲線出現拐點時的溫度，以此作為植物組織的低溫脅迫半致死溫度(LT50),相對電導率擬合成logistic回歸方程：

Y=K/(1+ae-bx)

(1)

LT50= -lna/b

(2)

式中：K為曲線的漸近線，即最大電解質滲出率，LT50是曲線的拐點溫度。Y為細胞傷害率，x為處理溫度，K為細胞傷害率的飽和容量，a、b是以處理溫度為自變量，以ln{(k-y)/y}為因變量的線性方程系數。

1.2.4 抗寒性綜合評價 根據各項生理指標測定值，應用隸屬函數法進行計算并綜合評價，此次試驗中相對電導率和MDA與抗寒性成負相關，故采用方程：

X(μ)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、SOD、POD活性與抗寒性成正相關，故用方程：

X(μ)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(4)

式中：Xij為各指標測定值，Xmax為不同梯度低溫處理下各指標的最大值，Xmin為各指標的最小值，累加各指標的X(μ)，求出平均值，平均值越大，抗寒性越強。

1.2.5 數據分析 用Microsoft office Excel 2010軟件進行數據整理和統計并作圖，用SPSS 19.0軟件進行隸屬函數計算及logistic方程擬合、方差分析等。采用系統聚類法對6個品種的抗寒性進行聚類，運用皮爾遜法進行半致死溫度(LT50)的求解，并對7個生理指標變化進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對枝條相對電導率的影響

隨著處理溫度降低，6個觀賞海棠品種的相對電導率呈增長趨勢，-10℃之前，相對電導率緩慢上升，-10℃之后，各品種相對電導率均上升明顯；-15～-20℃，雪球相對電導率增長26.17%，居首位，草莓果凍增長22.48%，僅次雪球，凱爾斯增長17.91%，絢麗、紅麗、火焰增長均趨于緩慢。至-25℃時，各相對電導率值，草莓果凍>雪球>紅麗>凱爾斯>火焰>絢麗,-20～-25℃，草莓果凍、雪球與其他品種間相對電導率差異顯著，且值明顯高于其他品種，說明草莓果凍、雪球耐寒性遠低于其他品種(圖1)。

圖1 低溫處理下枝條的相對電導率Fig.1 The relative conductivity of ornamental crabapple under low temperature stress注：圖中相同溫度下不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 低溫脅迫對枝條MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化產物，這種氧化會對細胞造成大的損傷，作為細胞毒害物質，其含量積累越多，表明其抗寒力越弱[9]。

隨著處理溫度降低,各品種海棠MDA含量呈上升趨勢，-5℃時，凱爾斯MDA含量最高，之后趨于緩和，-15～-20℃時，絢麗增長92.27%，凱爾斯增長58.65%，紅麗增長24.42%，-20℃下，絢麗、紅麗、火焰、雪球含量均達到最大值，-20～-25℃，草莓果凍含量持續上升，其余品種含量均下降，-25℃時，各品種含量：紅麗>絢麗>草莓果凍>凱爾斯>雪球>火焰，方差檢驗結果顯示，低溫脅迫下各品種觀賞海棠MDA含量差異顯著，故可以用MDA為單一指標評價幾種海棠的耐寒性強弱(圖2)。

2.3 低溫脅迫對枝條可溶性糖含量的影響

為抵御低溫，植物細胞可將蛋白質、淀粉等大分子物質降解轉化為可溶性糖，以增加細胞液濃度，調節細胞滲透壓平衡，降低水勢及冰點，提高其抗寒力。溫度不斷降低時，各品種海棠含糖量呈現低—高—低的增長趨勢；0℃下，凱爾斯與其他品種差異顯著，-5～-10℃，凱爾斯與草莓果凍的增長率達43.68%及33.34%,凱爾斯增長居于首位，-10℃時，草莓果凍含糖量達最高，之后迅速下降又回升，-25℃時仍高于0℃含量，-10～-15℃，草莓果凍的含糖量降低42.45%，其余品種均呈增長趨勢，-15～-25℃，火焰增長9.2%，紅麗增長12.50%，雪球增長15.66%，-25℃下，可溶性糖含量大小為：凱爾斯>雪球>絢麗>火焰>草莓果凍>紅麗(圖3)。

圖2 低溫處理下枝條MDA的含量Fig.2 The MDA concentration of ornamental crabapple under low temperature stress

圖3 低溫處理下枝條可溶性糖的含量Fig.3 The sugar content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.4 低溫脅迫對枝條可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白可作為細胞滲透調節物質抵御低溫，從而保護植物組織免受低溫傷害[11]。溫度持續下降時，可溶性蛋白含量總體呈高—低—高的增長趨勢，各觀賞海棠品種蛋白質含量在61.525～79.828 mg/g；0～-10℃，其含量緩慢上升，-10～-15℃，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，-15℃時，出現最低值，-20℃時，其值明顯上升，火焰增長4.72%，紅麗增長15.08%，凱爾斯增長17.91%，草莓果凍增長16.69%，絢麗增長達22.57%，增速最大；至-25℃時，各品種含量：雪球>火焰>絢麗>紅麗>草莓果凍>凱爾斯，且品種間可溶性蛋白含量差異不顯著(圖4)。

圖4 低溫處理下枝條可溶性蛋白的含量Fig.4 The soluble protein content of ornamental crabapple under low temperature stresss

2.5 低溫脅迫對枝條脯氨酸含量的影響

脯氨酸作為植物蛋白的主要成分之一，以游離態存在于植物細胞中，可用于合成蛋白質、脂質等大分子物質，其含量與抗寒性密切相關[12]。

隨著溫度不斷降低，脯氨酸含量總體呈低—高—低的“M”波動狀態，-5～-10℃，凱爾斯下降70.41%，草莓果凍下降58.70%，雪球下降50.08%，火焰下降75.63%，絢麗下降64.56%，-20～-25℃，脯氨酸含量迅速上升，紅麗增長104.39%，火焰增長174.47%，雪球增長173.35%，草莓果凍增長211.76%，其中草莓果凍增速最大，-25℃時其在絢麗的含量低于0℃含量，且絢麗與其他品種間差異顯著(圖5)。

圖5 低溫處理下枝條脯氨酸的含量Fig.5 The proline content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.6 低溫脅迫對枝條SOD酶含量的影響

低溫初期(0～-5℃)，除絢麗以外，海棠各品種SOD酶含量均有所上升，其中凱爾斯增幅最大，達82.72%，火焰次之，達39.35%；-5℃下，凱爾斯與火焰SOD酶含量出現峰值，-10～-15℃，除凱爾斯外，各品種SOD含量呈上升趨勢，-15℃下，草莓果凍、火焰、雪球與絢麗、紅麗、凱爾斯間差異顯著，-15～-20℃，雪球、凱爾斯、絢麗、火焰均呈下降趨勢，且降幅明顯；-20～-25℃，各品種含量均迅速增長，絢麗增長3.11倍，凱爾斯增長0.71倍，雪球增長0.44倍，草莓果凍增長0.07倍，其值最小。至-25℃時，SOD酶活性為草莓果凍>凱爾斯>火焰>紅麗>絢麗>雪球(圖6)。

圖6 低溫處理下枝條SOD酶的含量Fig.6 The SOD content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.7 低溫脅迫對POD酶含量的影響

POD是調節細胞內H2O2的主要酶類，起酶促降解的作用，可催化H2O2轉化為活性較低的H2O和O2，從而達到保護植物細胞膜的作用，其活性與抗寒性密切相關[14]。

0～-10℃，紅麗、絢麗、草莓果凍的POD酶活性均無明顯變化，凱爾斯先升后降，火焰、雪球先降后升，但變化幅度均不明顯,-10～-15℃，除雪球外，其余品種均呈增長趨勢；-15～-20℃時，各品種POD酶活性均迅速下降，出現最低值，-25℃時迅速上升，增幅為紅麗10.05倍，草莓果凍8.54倍，凱爾斯3.20倍，紅麗增長居于首位，凱爾斯居最后，這是植物響應低溫脅迫的保護性反應，抑制植物細胞在低溫脅迫下過氧化作用進一步加深。至-25℃，除火焰外，各含量均出現峰值，大小順序為：凱爾斯>紅麗>雪球>絢麗>火焰>草莓果凍，品種間POD酶活性差異顯著(圖7)。

圖7 低溫處理下枝條POD酶的含量Fig.7 The POD content of ornamental crabapple under low temperature stress

2.8 低溫脅迫下枝條半致死溫度的確定

利用不同溫度下各觀賞海棠品種的相對電導率值擬合非線性logistic方程，求得6個觀賞海棠枝條的半致死溫度(表1)。

將表1所示的數據，以不同溫度和相對電導率為參數進行Logistic方程非線性擬合，得到6個品種觀賞海棠Logistic方程及半致死溫度，所有方程擬合度均大于0.9，達到極顯著水平。半致死溫度越低，其抗寒性越強，其中凱爾斯的半致死溫度遠低于其他品種，達到-24.91℃；紅麗、絢麗、火焰的半致死溫度居中，均在-20～-22℃；而雪球、草莓果凍的半致死溫度最高，均在-20℃以上。

表1 供試枝條的logistic方程及半致死溫度

注：擬合度R2均達極顯著水平

2.9 抗寒性綜合評價

以上7種指標測定6個觀賞海棠品種抗寒性強弱差異各有不同，且有研究表明，低溫脅迫下，植物的抗性反應是一個復雜的生理、生化、生態過程[15]。并且各種生理指標間相互影響、相互作用，單一指標很難準確地評價抗寒性強弱,故采用兩種方法進行抗寒性綜合評價。

2.9.1 抗寒性聚類分析 將6個觀賞海棠的枝條不同低溫處理后，測定各指標，選取-25℃下各指標的測定值，進行聚類，在相似系數為5的水平上，可將6個

觀賞海棠的耐寒力分為3類，耐寒力最強為凱爾斯，耐寒力次之為絢麗，耐寒力較弱為草莓果凍、雪球、紅麗、火焰(圖8)。

圖8 6個觀賞海棠品種的抗寒性聚類分析Fig.8 Cluster analysis of six ornamental crabapple varieties to low temperature stress

2.9.2 隸屬函數分析法 綜合評價6個觀賞海棠的抗寒性強弱，對各級低溫處理下的枝條測定指標后，將各指標測定值用模糊數學隸屬度公式進行定量轉換(表2)。

表2 6個觀賞海棠品種的抗寒性綜合評價

注：1.可溶性糖；2.可溶性蛋白；3.SOD酶活性；4.POD酶活性；5.脯氨酸；6.丙二醛；7.相對電導率；Zij平均隸屬度

2.9.3 抗寒性各指標間的相關性 從試驗指標測定結果分析，各指標含量變化差異較大，為進一步明確各指標間的抗寒作用過程及觀賞海棠耐寒性機制，研究植物亞細胞受凍機理[16]，對耐寒性指標作相關性計算(表3)。

在0.05水平上，可溶性糖與相對電導率呈顯著正相關、與MDA呈極顯著負相關；可溶性蛋白與脯氨酸呈顯著正相關；POD酶活性與可溶性蛋白呈顯著負相關，SOD酶與可溶性糖呈顯著正相關(表3)。

表3 影響觀賞海棠抗寒性各指標間的相關性系數矩陣

注：*表示在0.05 水平(單側)上顯著相關；**表示在0.01 水平(單側)上顯著相關

3 討論

隨著脅迫溫度不斷降低，觀賞海棠各品種相對電導率值不斷上升，且相對電導率持續上升的實質是植物細胞膜損傷越嚴重，抗寒性越弱。MDA含量測定結果顯示，先上升至-20℃時再下降，作為細胞膜脂發生過氧化的毒害產物，MDA可與蛋白質結合，引起膜蛋白的變性，致使質膜流動性降低、代謝生理紊亂，細胞膜活性下降，其含量升高與相對電導率升高表征結果一致，植物受低溫凍害，細胞膜透性不斷增大，產生阻礙細胞正常生活的物質更多。MDA含量迅速下降，可能是SOD、可溶性糖、脯氨酸等起作用，抑制了MDA的合成[17]。

滲透調節是植物適應低溫逆境的一種主要方式，可溶性糖、可溶性蛋白等作為調節因子，可增大細胞膨壓，提高束縛水含量，防止因細胞過度失水，植物萎焉而死。試驗發現可溶性糖總體為上升趨勢，且有輕微波動狀態，海棠耐寒性越強，其含糖量越高，含量增幅越明顯。-10～-15℃，草莓果凍含糖量迅速下降39.6%，可能是由于其抗寒性較弱，在此溫度期間，脅迫溫度接近冰點溫度，需消耗自身熱量，維持正常生理活動引起的反應機制[18]；脯氨酸測定結果顯示，海棠抗寒性越弱，其含量積累越多，增幅越大，反之，越小。這與劉娥娥[19]等研究結果一致，說明低溫脅迫下，植物組織可積極調動脯氨酸等內源物質來抵御凍害；在低溫變化過程中，可溶性蛋白含量總體變化幅度不大，至-15℃時，含量迅速下降，可能是低溫限制了與合成蛋白質相關的酶活性，致使其含量合成受阻。

SOD、POD是植物逆境下的抗氧化酶系統，試驗發現SOD酶活性短暫升高后又下降，之后持續保持在較穩定狀態，SOD酶活性下降，可能是MDA含量增加，抑制了其活性變化，之后由于可溶性糖等含量上升，調節了細胞滲透壓，使得MDA含量下降，SOD 恢復自身活性；研究結果顯示，脯氨酸與可溶性蛋白呈顯著正相關，說明脯氨酸有利于蛋白質的合成與積累，利于抵御低溫脅迫；可溶性糖與相對電導率呈顯著正相關，與MDA呈顯著負相關，這與前人研究結果一致[20-22]，一定時間范圍內，細胞遭受低溫脅迫，膜透性增強，可溶性糖含量升高，以增加細胞滲透壓防止內含物外滲，延緩相對電導率上升速度，此時，膜的過氧化程度較低，MDA積累較少，當脅迫溫度接近冰點溫度時，細胞有害物質MDA大量產生，相對電導率迅速上升。

4 結論

6個觀賞海棠品種一年生枝條通過不同梯度低溫脅迫，其相對電導率、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸及SOD等的含量均有所上升；通過應用logistic方程，聚類分析、隸屬函數等綜合性評價方法，得出6個觀賞海棠品種的耐寒性強弱依次為凱爾斯>紅麗>絢麗>火焰>雪球>草莓果凍。

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