細胞膜色譜研究進展及其在中藥活性成分篩選中的應用

王曉宇 陳嘯飛 顧妍秋 曹巖 原永芳 洪戰英 柴逸峰

摘 要 細胞膜色譜法作為近年來發展迅速的生物色譜技術，已成為篩選中藥復雜體系中活性成分和研究藥物與受體相互作用的重要工具。本文綜述了細胞膜色譜技術的發展、分離原理、制備方法、針對其穩定性和壽命等問題進行的制備方法學優化、多種二維色譜方法學和應用策略，以及在中藥等復雜體系活性成分篩選中的應用情況。在此基礎上， 本文展望了細胞膜色譜技術未來的發展趨勢，以期為細胞膜色譜技術的進一步發展以及在藥物高通量篩選領域的拓展應用提供思路。

關鍵詞 細胞膜色譜法； 共價制備策略； 全二維細胞膜色譜分析系統； 中藥活性成分篩選； 評述

1 引 言

細胞膜色譜（Cell membrane chromatography， CMC）是近年發展迅速的一種生物親和色譜技術，以細胞膜與色譜載體作為固定相，采用色譜分析法，可在體外模擬藥物分子與細胞膜受體的相互作用過程。細胞膜色譜法將復雜成分分離與化合物活性篩選結合，具有操作方便、快速穩定、靈敏度高等優點，尤其適用于中藥等復雜體系的活性成分篩選。該技術自發明以來，經過方法學的不斷改進與完善，發展了近30種細胞膜色譜模型，成功應用于40余種中藥或復方的活性成分篩選，同時應用于研究藥物-受體相互作用[1]。本文對細胞膜色譜技術的研究進展及其在中藥活性成分篩選中的應用進行詳細綜述。

2 細胞膜色譜法的原理

細胞膜色譜法由西安交通大學賀浪沖教授課題組于1996年首次報道[2]，是一種以具有活性的細胞膜受體為固定相的仿生親合色譜技術，此技術利用細胞膜自身的融合作用和硅膠表面硅羥基（Si-OH）的吸附作用制備成細胞膜色譜固定相（Cell membrane stationary phase， CMSP），最大限度地保持了細胞膜的完整性、膜受體的空間結構以及生物活性[3]。細胞膜色譜固定相示意圖如圖1A所示，中心紅色球體代表硅膠，周圍橙色代表細胞膜的磷脂雙分子層，藍色代表細胞膜上的蛋白或受體，細胞膜和硅膠載體之間以氫鍵吸附作用結合，鍵合細胞膜后的硅膠載體掃描電鏡圖像如圖1B[3]所示。以 K+， Na+-三磷酸腺苷（K+， Na+-ATP）酶作為活性指標，測定結合硅膠后的細胞膜、混懸液狀細胞膜和沉淀狀細胞膜，這三者之間酶活性無差異，可見硅膠可作為細胞膜的理想載體[4]； 細胞膜色譜固定相具有色譜分離和活性表征的雙重功能，廣泛應用于復雜體系藥物活性成分的篩選分析以及藥物與膜受體相互作用分析。

3 細胞膜色譜法方法學研究進展

細胞膜色譜技術自建立以來得到了廣泛應用，但仍然存在一些問題有待解決。首先，柱壽命短，其主要原因在于附著在硅膠上的細胞膜蛋白容易脫落或失去活性，影響了篩選結果的穩定性和重現性。其次，對細胞膜色譜柱的制備質量缺乏一個較為統一的評價標準，這使得不同細胞膜色譜柱之間質量差異較大，難以獲得理想的重現性。此外，細胞膜色譜作為一種生物色譜，其本身的柱效和理論塔板數都較低，因此，細胞膜色譜與二維色譜串聯質譜的聯合使用大大提升了其作為篩選工具的適用性和通量。

3.1 細胞膜色譜柱制備條件優化

本課題組Ding等[5]對細胞膜色譜柱的制備過程中3個關鍵步驟（細胞用量、細胞破碎和裝柱流程）進行了方法學考察和優化，使細胞膜色譜柱壓更穩定、柱效更高，并對細胞膜色譜模型的制備過程進行了全面考察，建立起了一系列質控標準，為實驗室制定了該項技術的標準化操作流程，有效提高了細胞膜色譜模型制備的重現性。

細胞膜色譜柱在使用過程中，細胞膜表面的受體蛋白在使用過程中可能會發生失活，逐漸失去其原有的生物活性； 另一方面，固定相表面結合的細胞膜容易在流動相的沖洗下脫落，以上兩個原因導致細胞膜色譜柱的柱壽命較短，一般連續使用48～72 h后即失效。Ding等[5] 采用多聚甲醛處理鍵合了細胞膜的固定相，多聚甲醛可以與蛋白表面氨基交聯，同時使膜蛋白容易保持其空間構型，經此處理后細胞膜與硅膠的結合穩定性得到顯著提高。然而，多聚甲醛作為一種蛋白交聯劑，可能會導致蛋白結構破壞，活性下降，不能保證篩選結果的可靠性。因此，需要建立一種在不損傷細胞膜的同時，又能提高細胞膜在硅膠載體上的附著力的新方法。

Ding等[6]制備了一種3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane， APTES）修飾的硅膠，并應用于細胞膜色譜的制備過程中，改變傳統的細胞膜和硅膠載體之間主要靠氫鍵和范德華力的非共價結合模式，實現了硅膠載體和細胞膜之間以共價鍵結合。如圖2所示，其原理是以APTES為橋梁，連接一個戊二醛增加連接臂長度，在硅膠表面鍵合了醛基基團，而細胞膜是由豐富的磷脂組成的，含有大量氨基基團，因此鍵合在硅膠表面的醛基與細胞膜上氨基在室溫環境中易發生醛氨縮合反應，以共價鍵的形式結合，這大大提高了細胞膜在硅膠表面的附著力，同時又避免了對膜蛋白結構的破壞。該方法提高了細胞膜在硅膠載體表面的穩定性，降低了細胞膜脫落概率，有效延長了細胞膜色譜柱的使用壽命，從原有的不足3天延長到12天以上，此外，在柱活性下降最快的前3天，陽性藥吉非替尼的保留時間RSD也由20%下降到低于10%，重現性顯著提高。采用該方法制備的細胞膜色譜柱可用于一些難以培養、較難獲得的珍稀細胞，建立的模型可延長細胞膜生物活性，顯著提升了穩定性，提高了細胞膜色譜柱適應性。

3.2 細胞膜色譜分析系統優化

隨著分析儀器和分析方法的發展和進步，細胞色譜分析系統也得到了不斷的更新和提升，從最開始的單維細胞膜色譜分析系統到“中心切割”二維細胞膜色譜分析系統，以及近年發展的全二維細胞膜色譜分析系統。單維細胞膜色譜分析系統無法對篩選得到的結果直接進行分離和鑒定，在后續的分析過程中可能會丟失一些信息。而“中心切割”二維細胞膜色譜分析系統具有自己的分析鑒定系統，彌補了單維細胞膜色譜分析系統的不足，同時由離線發展到在線，減少了分析步驟，縮短了分析時間。而全二維細胞膜色譜分析系統可以同時實現在線、全自動的分析過程，并可對細胞膜色譜柱中所有的組分進行分離分析。

3.2.1 單維細胞膜色譜分析系統 單維細胞膜色譜分析系統，可以用細胞膜色譜柱作為分離分析系統，根據化合物在細胞膜色譜圖上的保留行為，篩選出潛在活性成分。單維細胞膜色譜分析系統如圖3所示，將復雜體系的樣品進樣到細胞膜色譜中，根據細胞膜色譜的分離分析功能將樣品進行分離，在由檢測器給出保留行為圖譜。趙小娟等[7]制備了犬血管細胞膜色譜，對淫羊藿根與葉的活性成分進行了分析比較，結果表明，淫羊藿根乙醚提取物在細胞膜色譜上有保留行為。進一步將淫羊藿根乙醚提取液用高效液相色譜分離得到17個樣品，再用細胞膜色譜對該17個樣品進行分析，結果表明，有2個成分（YYH-214，YYH-216）和陽性藥維拉帕米一樣能在細胞膜色譜系統上產生保留行為。張漢利等[8]應用大鼠血管和心肌細胞膜色譜篩選出太白花中含有對主動脈血管有舒張作用、對心肌收縮有抑制作用的有效成分。高琨等[9]采用大鼠血管細胞膜色譜篩選出紅毛七中對主動脈血管有舒張作用的有效成分。該方法的不足之處在于無法對篩選得到的有效成分進行直接分離和鑒定，需借助另一種分析系統進一步對有效部位進行分離分析，步驟繁瑣耗時，第一維色譜的信息有所丟失。

3.3.2 “中心切割”二維細胞膜色譜分析系統 鑒于細胞膜色譜本身分離效能的局限性和檢測系統單一性的問題，單維細胞膜色譜分析系統無法同時做到對有效活性組分的高效分離、快速識別和準確鑒定，因此需借助快速的分離系統和高靈敏的檢測系統對活性組分進行進一步的分離鑒定。為了實現自動化分析篩選活性成分，研究者發展了一種離線“中心切割”二維色譜離線分析方法，該方法的原理是將第一維的組分通過檢測器識別后，將潛在的活性組分分別收集，離線導入第二維液相色譜串聯質譜（HPLC-MS）或氣相色譜串聯質譜（GC-MS）進行離線分析。如文獻[10，11]采用血管內皮細胞膜色譜-GC-MS方法篩選白芷、羌活、北沙參、蛇床子和五味子，發現歐前胡素、蛇床子素和五味子甲素對血管平滑肌細胞有舒張作用。文獻[12，13]采用腹腔巨噬細胞膜色譜-GC-MS方法篩選白術和羅田蒼術，發現白術內酯I對腹腔巨噬細胞有抗炎作用。然而，這種離線二維方法需要對色譜流份進行收集和富集，步驟較為繁瑣，耗時較長。研究者又發展了一種“中心切割”二維細胞膜色譜在線分析系統，樣品通過細胞膜色譜柱分離后可直接進入MS系統進行識別和鑒定，大大減少了工作量，縮短了分析時間，實現了實時在線監測分析，如CMC-online-HPLC/MS[14]。Li等[15]建立HEK293/VEGFR-CMC-online-HPLC/MS方法篩選烏頭中作用于VEGFR-2受體的抗癌活性成分有中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿。Sun等[16]建立A431/CMC-online-HPLC/MS方法篩選紅毛七總生物堿中作用于人EGFR受體活性成分有塔斯品堿和紅毛新堿。Wang等[17]建立α1AAR-CMC-online-HPLC/MS方法篩選紅毛七中作用于人α1A-腎上腺素受體的活性成分有木蘭花堿和紅毛新堿。Wang等[18]建立A431/CMC-online-HPLC/MS方法篩選苦參中EGFR受體拮抗劑有氧化苦參堿和苦參堿。Ren等[19]建立Prostate/CMC-online-HPLC/MS方法篩選蓮子心中作用于α1A-AR受體的具有抗前列腺癌作用的活性成分有蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿。研究表明，在線二維細胞膜色譜技術為中藥復雜體系中活性成分的快速篩選、同分異構體的表征、動物攝取中藥后體內代謝產物的檢測提供了一種高效、快速、適用性強的方法體系[20]。

3.3.3 全二維細胞膜色譜分析系統 目前，“中心切割”二維細胞膜色譜模式仍存在下列問題：（1）第一維紫外檢測器的識別可能忽略一系列低紫外吸收的活性成分； （2）第二維使用常規的HPLC或GC-MS需要較長的分離分析時間； （3）常規質譜定性能力弱，一般需要對照品來鑒別非靶標組分，而中藥復雜成分標準品較難獲得，從而影響了細胞膜色譜分析的通量和準確度。為解決上述問題，本課題組發展了一種新的全二維細胞膜色譜分析系統。Chen等[21]首次建立全二維HepG2肝癌/CMC/整體柱/TOFMS分析系統，并應用于篩選黃柏和苦參中抗肝癌活性成分，該系統組成如圖4所示。全二維系統的第一維色譜是細胞膜色譜柱，由一個單元泵輸送流動相10 mmol/L醋酸銨溶液，第二維色譜是反相色譜柱，由一個二元泵負責輸送流動相，實現梯度洗脫。為實現第一維與第二維色譜同步分析，用一個十通閥將這兩維色譜橋連起來，并設置為每隔 2.5 min進行自動切換。在A和B 狀態的不斷切換過程中，第一維細胞膜色譜柱的全部組分都能夠進入到第二維色譜分離柱中進行分離，并串聯高分辨的飛行時間質譜儀（TOF/MS）進行數據采集和分析。在此全二維系統中，第一維組分可以全部流入第二維色譜柱中進行進一步的分離分析，因此，無需對第一維的組分進行鑒定和表征，可利用第二維分離柱-TOF/MS強大的分離和鑒定能力，結合MATLAB工作站的數據處理和繪圖功能對有親和活性的組分進行快速表征和鑒別，成功彌補“中心切割”二維色譜的一些缺陷和不足。在此基礎上，Chen等[22]建立正常/阿霉素誘導心衰比較全二維CMC/整體柱/TOF-MS方法篩選附子中抗阿霉素誘導的心力衰竭的活性成分，通過構建正常大鼠的心肌組織細胞膜色譜系統和衰竭大鼠的心肌組織細胞膜色譜系統，比較附子提取液在兩者之間保留行為差異，從附子中成功篩選出16種心肌細胞膜結合成分和3種專屬性的抗心衰活性成分，比較全二維色譜圖譜如圖5所示。Wu等[23]建立全二維K562/CMC/C18柱/TOF-MS系統篩選青黛中抗白血病活性成分。Wang等[24]建立SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC18柱/TOF-MS系統，成功地對一系列人工合成的VEGFR抑制劑的活性進行排序。考慮到在生物體內的靶組織上實際起作用的活性成分不一定是小分子，也有可能是其代謝產物，全二維細胞膜色譜不僅可應用于篩選中藥提取液中潛在活性成分，也適用于中藥體內代謝產物的篩選。Jia等[25]建立了全二維HepG2 肝癌/CMC/C18柱/TOF-MS 分析系統，篩選口服黃芩提取液后的大鼠血清中抗肝癌活性成分。全二維分析系統通量高，準確性、專屬性、適用性良好，極大提高了細胞膜色譜技術的分辨能力，且TOF-MS可提供每一個活性組分的精確質量信息和豐富的離子碎片信息，在沒有標準品的條件下也可以獲得可信的化合物鑒別分析結果，因此十分適用于中藥等天然藥物的復雜體系中有效的活性成分的篩選。

4 細胞膜色譜技術在中藥活性成分篩選中的應用

中藥及天然藥物中成分繁多且復雜，如何快速鑒定其中的活性組分一直是中藥藥效物質基礎研究的難題。隨著細胞膜色譜分析系統的快速發展，細胞膜色譜法從中藥及天然藥物中篩選有效活性成分的應用越來越廣泛。此外，二維細胞膜色譜系統具有方法快速、操作簡捷、穩定可靠等特點，越來越多地應用于中藥復雜體系活性成分的篩選[26]。表1中列出了近年細胞膜色譜用于中藥活性成分篩選的應用研究的統計和概述。

5 總結和展望

細胞膜色譜技術經歷了二十余年的發展，多個課題組對細胞膜色譜制備方法學進行了全面的考察和研究，其制備過程得到不斷的完善和優化。重要的是，細胞膜色譜分析系統從最開始的單維細胞膜色譜分析系統，發展到“中心切割”二維細胞膜色譜分析系統，再到全二維細胞膜色譜分析系統，從離線發展到在線，不斷減少分析步驟、縮短分析時間，提高了準確性和通量。大量研究表明，新型細胞膜色譜制備技術結合全二維色譜串聯高分辨質譜技術非常適用于復雜體系中活性成分的篩選。然而，在細胞膜色譜系統中，為了保證分析的有效性，通常需要大量細胞（約3 × 107個）進行色譜柱的制備，無法適用于原代細胞等難以獲得或擴增的珍稀細胞系。Tang等[52]嘗試將細胞膜色譜搭載于在石英毛細管上，建立了毛細管細胞膜色譜，并應用于篩選天然產物中活性成分； Zhang等[53]首次建立了開放管狀毛細管細胞膜色譜，具有與普通CMC相似的色譜保留因子和穩定性，但細胞膜消耗量比CMC低數百倍。然而，這類開管的毛細管細胞膜色譜存在均一性低、無法與二維色譜、質譜在線串聯等問題。因此，建立基于微型/nano色譜柱的細胞膜色譜多維分析系統是細胞膜色譜方法學發展的趨勢。同時，微型/nano色譜具有靈敏度高、細胞用量少、可陣列化等優點，使得細胞膜色譜在高通量藥物-受體相互作用表征和化學生物學等領域展現出良好的應用前景。細胞膜色譜技術作為一種兼有色譜分離和活性篩選雙重特性的藥物活性分析方法，未來將向集成化、微型化、陣列化和自動化的方向快速發展。

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