DNA輔助識別的西馬特羅分子印跡傳感器

張連明 張東友 曾英 李建平

摘 要 利用DNA改善印跡孔穴對模板分子空間識別性能，建立了高選擇性印跡材料的制備新方法，并用于痕量西馬特羅的測定。在金電極表面自組裝固定雙鏈DNA，待西馬特羅與DNA雙鏈進行結合后，以西馬特羅-DNA復合物為模板，電聚合制備西馬特羅-DNA復合物的分子印跡聚合物膜。去除待測分子西馬特羅，得到對西馬特羅具有高特異性識別能力的分子印跡傳感器。對傳感器制備及工作條件進行了優化，利用紫外吸收光譜對西馬特羅與DNA的結合方式進行了研究。結果表明，二者之間的相互作用模式為溝槽式結合。印跡膜以乙醇-乙酸（8∶1，V/V）為洗脫劑，洗脫時間為35 min，重吸附時間為45 min。以鐵氰化物作為探針，其氧化電流與西馬特羅濃度在1.0 × 1013～1.0 × 1010 mol/L范圍內呈線性關系，檢出限為3.2×1014 mol/L（S/N=3）。將傳感器成功應用于豬肉樣品中西馬特羅的檢測，結果良好。

關鍵詞 分子印跡； 西馬特羅； 電化學傳感器； DNA； 選擇性識別

1 引 言

西馬特羅（Cimaterol，CIM）是繼萊克多巴胺、沙丁胺醇和克倫特羅之后的新型“瘦肉精”[1]。因西馬特羅可以減少胴體脂肪含量，促進家畜生長，改變肉質，經常被非法加入到肉畜飼料中[2]。長期大量使用西馬特羅會使其在動物組織內積累殘留，造成食用者中毒，產生目眩、惡心、嘔吐、心率加快等癥狀，嚴重者可導致死亡[3]。我國農業部公告第193號文件明確規定西馬特羅禁止在畜禽生產中使用[4]。現有的檢測動物組織中西馬特羅的方法主要有氣相色譜-質譜法[5，6]、高效液相色譜法[7，8]、液相色譜-串聯質譜法[9，10]、酶免疫分析法[11，12]和毛細管電泳法[13，14]等。但是，這些方法均存在一定的缺陷，如樣品前處理繁瑣、檢測耗時過長、樣品中組份對分析干擾較大等[15]。因此，發展操作簡便、靈敏度高、選擇性好、無需復雜前處理過程的西馬特羅殘留檢測方法具有重要意義。

分子印跡聚合物（MIPs）是一類對目標分子具有專一性識別能力并具有記憶功能的聚合物[16～18]。雖然各種瘦肉精分子印跡聚合物已見報道[15，19]，但是，這些分子印跡聚合物由于印跡孔穴識別單元種類和數量不多， 尚不能對結構相近、官能團相似的瘦肉精分子作有效地分辨[20]。因此，提高印跡聚合物材料的專一性識別能力，發展高特異性西馬特羅識別方法很有必要。

DNA由于其特殊鏈狀結構及含有豐富的活性基團已被廣泛應用于分子識別領域。Nicholas等[21]利用單鏈DNA（ssDNA）與蛋白質之間的結合作用，制備了蛋白質分子印跡聚合物。Li等[22]以林可霉素分子為靶物質，在堿基庫中篩選出對其具有高親和性的適配體，以適配體-林可霉素復合物為模板分子電聚合于石墨烯表面，發展了一種適配體-分子印跡傳感器制備方法，該方法借助ssDNA的基團增加印跡膜的識別位點可以增強MIPs的識別能力，然而，印跡孔穴內模板分子空間排列的立體選擇性并沒有得到有效改善。研究表明，不同堿基互補可以形成不同的雙鏈DNA（dsDNA）溝槽結構，生物分子可以嵌入dsDNA的溝槽[23，24]，這種結合方式對生物分子在印跡孔穴中的空間排列可提供構象選擇性。

本研究將dsDNA與有機分子溝槽結合產生的構象選擇性引入分子印跡聚合物材料的制備，以進一步提高印跡聚合物的專一性識別能力。以西馬特羅為目標分子，通過AuS鍵將dsDNA固定在金電極表面，待 dsDNA與西馬特羅分子結合后，以復合物為模板，電聚合形成分子印跡聚合物。去除西馬特羅后，得到與西馬特羅在作用位點、結構及3D構象相匹配互補的印跡孔穴，據此對西馬特羅進行高選擇性識別； 采用鐵氰化物作為探針，實現西馬特羅的定量測定。識別機理如圖1所示。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

PGSTAT 128N Autolab電化學工作站（瑞士萬通有限公司），采用三電極系統：工作電極為DNA/MIPs修飾金電極（Φ=3 mm），Ag/AgCl（飽和KCl）電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極； UV-2400PC紫外-可見分光光度計（日本島津公司）； S4800場發射掃描電子顯微鏡（日本日立有限公司）。

西馬特羅（CIM）、鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、班布特羅、馬布特羅、西布特羅、溴布特羅標準品（德國Witega Laboratorien公司）； DNA序列（ssDNA序列為：AGAGAG-C6-3′-SH，互補DNA序列為：SH-5′-C6-CTCTCT）由上海生物工程技術服務有限公司合成，使用時用TE緩沖液（10.0 mmol/L Tris-HCl，100.0 mmol/L NaCl，1.0 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制和稀釋； 0.1 mol/L HCl，乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）、 乙酸乙酯、 10% Na2CO3溶液、 Tris-HCl緩沖溶液（0.24 mol/L HCl，0.002 mol/L Tris，pH 7.47）、 0.05 mol/L 三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）、 鄰苯二胺（o-PD，Aladdin公司）。探針分子溶液是含有0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]溶液，若無特殊說明，所用試劑均為分析純。實驗用水均為二次去離子水。

2.2 DNA/MIPs、DNA/nMIPs及常規印跡傳感器的制備

將金電極用氧化鋁粉在麂皮上打磨至鏡面。將ssDNA與其互補鏈分別取出解凍10 min并離心， 用TE緩沖液溶解，并用TCEP溶液進行活化1 h后得到1.0×105 mol/L ssDNA及互補鏈（TCEP活化的目的是將巰基修飾的ssDNA之間自然形成的雙硫鍵斷開，便于AuS鍵結合）。將金電極浸入ssDNA溶液2 h，使ssDNA通過AuS鍵結合于金電極表面，將上述修飾電極浸入互補DNA鏈溶液2 h， 得到雜交后的dsDNA修飾金電極。將修飾dsDNA的金電極置于4.6×105 mol/L西馬特羅溶液中孵育3.5 h， 使西馬特羅與dsDNA結合。以1.0×104 mol/L 鄰苯二胺為功能單體，電聚合制備得到印跡聚合物膜（循環伏安掃描電位范圍：0～0.8 V，掃描速率為0.05 V/s，掃描圈數為25）。以乙醇-乙酸（8∶1， V/V）為洗脫液，將上述修飾電極置于洗脫液中輕微攪拌35 min， 除去西馬特羅，得到對西馬特羅具有特異性識別能力的DNA/MIPs傳感器。利用相同方法制備了非分子印跡修飾電極（DNA/nMIPs傳感器，制備過程中不添加西馬特羅）及常規分子印跡傳感器（MIPs傳感器，制備過程中不添加DNA）。

2.3 實驗方法

將傳感器置于不同濃度的西馬特羅溶液中重吸附45 min后檢測。在含有0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]的探針溶液中，考察傳感器的電化學性能。差分脈沖伏安法（DPV）參數為：初始電位0.2 V，終止電位+0.6 V，振幅0.05 V，掃速50 mV/s。交流阻抗法（EIS）頻率范圍為100 mHz～100 kHz，振幅為5 mV。

2.4 樣品處理

豬肉樣品購于本地超市， 按農業部標準方法（NY/T 486-2006）處理[25]。取5 mL乙酸乙酯和0.6 mL 10% Na2CO3加入1.0 g磨碎的樣品攪拌均勻，經3500 r/min離心，收集有機層，重復操作并收集提取液，待測。

3 結果與討論

3.1 自組裝時間及雜交時間的選擇

考察了ssDNA自組裝時間（圖2，曲線a）及互補DNA雜交時間（圖2，曲線b）對電極電化學響應信號強度的影響。當ssDNA濃度為1.0×105 mol/L時，響應信號隨自組裝時間延長而明顯降低，

當自組裝時間超過120 min后，響應信號強度趨于穩定，表明自組裝過程達到飽和。將上述修飾電極置于1.0×105 mol/L互補鏈溶液中進行孵育雜交，隨著雜交時間延長，響應信號強度逐漸下降，于120 min后趨于穩定。因此選擇自組裝時間及雜交時間均為120 min。

3.2 dsDNA與西馬特羅相互作用研究

利用紫外-可見吸收光譜法研究了西馬特羅與dsDNA之間的相互作用。作用時間對CIM-dsDNA復合物形成的影響如圖3A所示，修飾電極響應信號強度隨著孵育時間的延長而顯著降低，表明隨著孵育時間延長，越來越多的西馬特羅與dsDNA結合，當孵育時間達到210 min后， 西馬特羅的結合量達到飽和，響應信號強度趨于穩定。因此，后續實驗選擇西馬特羅與dsDNA的作用時間為210 min。 以Tris-HCl為緩沖液，分別研究了1.2 × 107mol/L西馬特羅溶液、1.2 × 107 mol/L dsDNA溶液及1.2 × 107 mol/L 西馬特羅-dsDNA復合物溶液的吸收光譜（圖3B）。結果表明，西馬特羅在320 nm處有明顯的紫外吸收，而dsDNA在290 nm處有最大吸收，西馬特羅與dsDNA相互結合后，西馬特羅-dsDNA （CIM-dsDNA） 復合物最大吸收波長位于320 nm，同時其最大吸收峰強度明顯增強，表明dsDNA與西馬特羅通過弱作用力相互結合，無新官能團產生。上述結論與文獻[26]相同。

3.3 聚合條件的選擇

以洗脫效果、印跡膜穩定性及識別效果為考察標準，利用DPV研究了聚合物底液中模板分子西馬特羅與功能單體（鄰苯二胺）的配比、掃描速率和電聚合掃描圈數的影響。掃速及掃描圈數直接影響印跡膜的厚度及致密度，進而影響洗脫效果及識別效果。實驗結果表明，在1.0 × 105 mol/L ssDNA、1.0 × 105 mol/L互補鏈及4.6 × 105mol/L西馬特羅條件下，使用1.0 × 104 mol/L o-PD作為功能單體、掃描速率為0.05 mV/s、電聚合掃描圈數為25圈時，傳感器對目標分子響應效果最佳。

3.4 DNA/MIPs及DNA/nMIPs傳感器對西馬特羅的響應

為驗證DNA/MIPs傳感器對西馬特羅的識別響應，對傳感器制備過程中的電化學性能進行了研究。如圖4A所示，裸金電極（曲線a）具有良好的導電性，而dsDNA（曲線b）及西馬特羅-dsDNA復合物（曲線c）在電極表面組裝后，修飾電極響應信號強度隨修飾物的增加而減弱。繼續聚合一層致密的聚o-PD層后，由于聚合物層的存在， 嚴重阻礙了電子的傳遞，響應信號強度急劇下降（曲線d）。洗脫西馬特羅后，印跡孔穴可以作為電子傳遞的通道，響應信號增強（曲線e）； 當重吸附不同濃度西馬特羅后，西馬特羅重新占據印跡孔穴通道而阻礙電子傳遞，響應信號強度隨西馬特羅濃度增加而降低（曲線f和曲線g）。上述結果表明，本方法制備的印跡材料能夠識別西馬特羅。

為了進一步證明上述結論，利用交流阻抗法對上述過程進行了研究（圖4B），當dsDNA-西馬特羅復合物修飾在裸金電極表面后（曲線b），其阻抗值較裸電極（曲線a）明顯增加，聚合后，由于存在致密的、導電性差的聚合物膜，阻礙了電子的傳遞過程， 因此敏感膜阻抗值較CIM-dsDNA修飾電極明顯增大（曲線c）； 洗脫目標分子后，由于印跡孔穴可以作為電子傳遞的通道，因此阻抗值降低（曲線d），而重吸附西馬特羅后，印跡孔穴通道被堵塞，敏感膜阻抗值增加（曲線e）。綜上，本方法制備得到的印跡聚合物材料對西馬特羅有識別能力，所得結論與DPV響應結論一致。

為了排除物理吸附的干擾，研究了非分子印跡膜DNA/nMIPs傳感器對目標分子西馬特羅的識別能力。如圖4C所示，將dsDNA修飾在電極表面后，探針分子響應明顯（曲線a）。電聚合后，由于致密的聚合物膜存在，修飾電極響應信號強度急劇降低（曲線b），而洗脫后，修飾電極響應信號強度無較大變化（曲線c），重吸附西馬特羅后，修飾電極響應信號強度仍無明顯變化（曲線d），這是因為聚合過程中未加入西馬特羅，因此洗脫后無任何印跡孔穴產生，即不會產生探針分子到達電極表面的通道，因而響應信號基本無變化。重吸附后，西馬特羅不能穩定存在于敏感膜表面，因此響應信號無明顯變化。上述研究表明DNA/nMIPs修飾電極對西馬特羅無任何響應。

3.5 分子印跡聚合物膜形貌表征

利用掃描電鏡（SEM）對金電極表面電聚合制備的dsDNA/MIPs敏感膜進行了形貌分析，如圖5所示，電極表面的分子印跡膜覆蓋較為完整，分布較為致密。

3.6 實驗條件優化

綜合考慮洗脫效果、印跡材料穩定性、 DNA雙鏈結構的影響等因素，分別以乙醇、甲醇、二甲亞砜、乙酸、HNO3-H2O混合液（1∶1，V/V）、乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）、甲醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）作為洗脫劑， 考察洗脫效果。實驗結果表明，以乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）作為洗脫液，洗脫時間較短，對印跡膜的穩定性影響最小。同時，隨著洗脫時間延長，傳感器響應信號強度逐漸增大，表明越來越多的目標分子被洗脫，當洗脫時間超過35 min后，傳感器響應信號強度不再變化，并趨于穩定，因此選擇最佳洗脫時間為35 min。

傳感器對西馬特羅的識別過程中，不僅要滿足dsDNA對其的構象識別，同時也要滿足印跡孔穴對其結構、大小及作用位點的互補識別。考察了重吸附時間對識別4.6× 1010 mol/L西馬特羅的影響，結果表明，隨著重吸附時間延長，傳感器響應信號強度逐漸降低，并于45 min后趨于穩定，表明西馬特羅與dsDNA的結合及印跡孔穴的結合達到飽和。因此選擇重吸附飽和時間為45 min。

3.7 傳感器對西馬特羅的分析性能

在最佳實驗條件下，考察了傳感器對不同濃度的西馬特羅溶液響應情況（圖6）。西馬特羅的濃度在1.0×1013～1.0×1010 mol/L范圍內，隨著濃度增大，傳感器響應信號強度逐漸降低，且傳感器響應信號強度與西馬特羅濃度呈線性關系，線性方程為Δi（μA）=9.255lgC-87.47，相關系數r=0.9960， 檢出限（3S/K）為3.2×1014 mol/L （0.007 ng/L）。與已報道方法相比，本方法具有較高的靈敏度（表1）。

3.10 實際樣品分析

按照2.4節的方法對豬肉樣品進行處理，將DNA/MIPs傳感器與樣品待測液孵育45 min，記錄電化學響應信號值。同時，進行加標回收實驗（樣品2加標后超出檢測范圍，經稀釋后檢測）。結果如表2所示，DNA/MIPs傳感器對西馬特羅測定結果的回收率為94.0%～105.5%，與HPLC法所得結果一致[31]，表明此傳感器可應用于豬肉樣品中西馬特羅檢測。

4 結 論

將dsDNA-有機分子的嵌合作用與分子印跡技術相結合，以固化分子印跡孔穴內模板分子的空間排列，有效提高了分子印跡膜的識別能力。本傳感器構建策略適用于可與DNA進行溝槽式結合的有機分子的分離測定，為食品等復雜樣品分析檢測提供了一種新方法。

References

1 XU Chuan-Lai， PENG Chi-Fang， HAO Kai， JIN Zheng-Yu， WANG Wu-Kang. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（5）： 699-702

胥傳來， 彭池方， 郝 凱， 金征宇， 王武康. 分析化學， 2005， 33（5）： 699-702

2 SUN Xiao-Liang， LI Xue-Lian， CAO Xu-Min， YANG Yan-Fei， WANG Juan， WANG Shu-Ting， ZHAO Si-Jun. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（1）： 124-132

孫曉亮， 李雪蓮， 曹旭敏， 楊艷菲， 王 娟， 王淑婷， 趙思俊. 分析化學， 2017， 45（1）： 124-132

3 Du X D， Wu Y L， Yang H J， Yang T. J. Chromatogr. A， 2012， 1260（10）： 25-32

4 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People′s Repubic of China No 19.-4-2002. The List of Forbidden Veterinary Durgs and Other Compounds in Foodstuff of Animal Origin

農業部公告， 第193號公告-4-2002， 食品動物禁用的首要及其化合物清單

5 CAI Qin-Ren， WU Jie-Shan， QIAN Zhen-Jie， PENG Yu-Fen， CAI Jie， DU Zhi-Feng. Chinese Journal of Chromatography， 2013， 31（3）： 200-205

蔡勤仁， 吳潔珊， 錢振杰， 彭玉芬， 蔡 杰， 杜志峰. 色譜， 2013， 31（3）： 200-205

6 Hsu R Y， Liao J H， Tien H W， Her G R. J. Mass Spectrom.， 2016， 51（10）： 693-698

7 Sun X， Tang Q， Du X， Xi C， Tang B， Wang G， Zhao H. Food Anal. Method.， 2017， 10（10）： 3239-3246

8 Li J， Zhang Z， Liu X， Yan H， Han S， Zhang H， Cheng J. Food Anal. Method.， 2014， 7（5）： 977-985

9 Suo D C， Zhao G L， Wang P L， Su X O. J. Chromatogr. Sci.， 2013， 52（7）： 604-608

10 Liu Y， Uboh C E， Soma L R， Li X， Guan F， You Y， Chen J W. Anal. Chem.， 2011， 83（17）： 6843-6841

11 Li C， Li Y， Zhang Y， Liu J， Li J， Wu M， Yang Z. Anal. Methods， 2018， 10： 548-553

12 HU Hua-Jun， FU Tao， ZHANG Ming-Zhou， HONG Zhi， CHEN Zong-Lun， LIU Jun. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（12）： 1727-1731

胡華軍， 付 濤， 張明洲， 洪 治， 陳宗倫， 劉 軍. 分析化學， 2010， 38（12）： 1727-1731

13 Fejs I， Varga E， Benkovics G， Darcsi A， Malanga M， Fenyvesi ， Béni S. J. Chromatogr. A， 2016， 1467（10）： 454-462

14 Chen Y， Wang W， Duan J， Chen H， Chen G. Electroanalysis， 2010， 17（8）： 706-712

15 ZHANG Lian-Ming， HUANG Xiao-Yun， ZHANG Ying-Ming， LI Jian-Ping， ZHANG Lan， ZENG Ying. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（10）： 1477-1481

張連明， 黃小云， 張英明， 李建平， 張蘭， 曾 英. 分析化學， 2016， 44（10）： 1477-1481

16 BAI Hui-Ping， WANG Chun-Qiong， CAO Qiu-E. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（10）： 1535-1541

白慧萍， 王春瓊， 曹秋娥. 分析化學， 2017， 45（10）： 1535-1541

17 Zhong C， Yang B， Jiang X， Li J. Curr. Anal. Chem.， 2018， 48（1）： 15-32

18 Li J， Li Y， Zhang Y， Wei G. Anal. Chem. ， 2012， 84（4）： 1888-1893

19 Guo P， Luo Z， Xu X， Zhou Y， Zhang B， Chang R， Fu Q. Food Chem. ， 2017， 217（2）： 628-636

20 Liu G， Liu H，Kadir A. Med. Biol. Eng. Comput.， 2014， 52（9）： 741-747

21 Nicholas W T， Christopher W J， Keith R B. Biotechnol. Porg.， 2006， 22（6）： 1474-1489

22 Li S， Liu C， Yin G， Zhang Q， Luo J， Wu N. Biosens. Bioelectron.， 2017， 91（2）： 687-691

23 Tang Q， Ma G， Zhang W， Yu N. Int. J. Digit. Crime Forensics， 2014， 6（4）： 1-13

24 WU Shang-Rong， JIN Bing， ZHANG Nan， LIU Ying， LIU Xiang-Jun， LI Song-Qing， SHANGGUAN Di-Hua. Chem. J. Chin. Univ.， 2014， 35（10）： 2085-2092

吳尚榮， 金 冰， 張 楠， 柳 影， 劉祥軍， 李松青， 上官棣華. 高等學校化學學報， 2014， 35（10）： 2085-2092

25 NY/T 486-2006， Determination of Clenbuterol Hydrochloride in Animal Tissues. Agricultural Industry Standards of the People′s Republic of China

動物組織中鹽酸克倫特羅的測定. 中華人民共和國農業行業標準. NY/T 486-2006

26 Bi S， Zhao T， Wang Y， Zhou H， Pang B.Spectrochim. Acta A， 2015， 150（11）： 921-927

27 Chen Y， Wang W， Duan J P， Chen H Q， Chen G N. Electroanalysis， 2005， 17（8）： 706-712

28 Yoon Y K， Woan T N， Karen O， Michael Z. Asian Pac. J. Trop. Med.， 2014， 4（3）： 244-248

29 Liu R， Liu L Q， Song S S， Cui G， Zheng Q K， Kuang H， Xu C L. Food Arg. Immunol.， 2017， 28（4）： 625-638

30 Yang F， Liu Z C， Lin Y H， Chen J， Pang G F， Chen G N. Food Anal. Method.， 2012， 5（1）： 138-147

31 GB/T 22286-2008， Determination of a Variety of β-Agonist Residues in Animal Derived Food. National Standards of the People′s Republic of China

動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法. 中華人民共和國國家標準. GB/T 22286-2008