液相色譜—穩定同位素質譜聯用鑒定咖啡飲料中咖啡因天然來源

丁博 王志元 陳文銳 謝建軍 佘志剛

摘 要 建立了液相色譜-穩定同位素質譜聯用 （LC-IRMS）檢測咖啡因的δ13C分析方法，用于鑒定咖啡飲料中咖啡因天然來源的真實性。樣品中咖啡因經液相色譜分離純化，色譜條件為： XBridge Shild RP C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）， 柱溫50℃，流動相為超純水，流速400 μL/min； 再通過LC-IsoLink實現目標物全部氧化為CO2氣體，最終以氣態形式進入穩定同位素質譜儀，直接檢測樣品中咖啡因的δ13C。檢測44個不同產地來源的咖啡豆樣品中咖啡因的δ13C，其范圍是25.3‰～30.9‰， δ13C平均值δaverage=27.9‰， 標準偏差s=1.3‰，以3倍δ13C標準偏差s為判斷依據，檢測16個咖啡飲料樣品的咖啡因δ13C，結果表明，1個咖啡飲料樣品中咖啡因δ13C在3倍標準差線附近（δaverage-3s， 31.7‰）， 判別其咖啡因為非咖啡豆來源。LC-IRMS同位素質譜測定咖啡因δ13C的分析方法，可用于鑒別咖啡飲料天然來源的真實性。

關鍵詞 液相色譜-穩定同位素質譜聯用； 咖啡飲料； 咖啡因

1 引 言

咖啡和咖啡飲料是常見的飲品[1]，具有提神的作用，其主要功效成分是咖啡因[1]。適量攝入咖啡因能振作精神、增強思考能力、提高心臟功能、緩解肌肉疲勞[2，3]。飲用天然咖啡因比人工合成咖啡因更加健康，因為人工合成咖啡因可能會導致焦慮癥、睡眠失調等副作用[4，5]。伴隨著天然咖啡因需求量增大，其導致價格越來越高，一些不法廠商以人工合成咖啡因替代天然咖啡因。如何鑒別天然咖啡因與人工合成咖啡因，是咖啡飲料天然成分鑒定的關鍵技術難題。

穩定同位素技術是食品摻雜和溯源分析領域一項重要技術，尤其是特定化合物同位素分析技術開發應用的完善，使同位素質譜技術在食品領域得到迅速的發展[6，7]。氣相色譜-同位素質譜（GC-IRMS）與液相色譜-同位素質譜（LC-IRMS）是兩種主要的特定化合物同位素分析技術，廣泛應用于環境科學和食品科學等領域[8]。GC-IRMS由于具有良好的接口串聯技術，在食品摻雜與溯源分析領域應用廣泛，GC-IRMS主要適用于揮發性或半揮發性目標物同位素質譜分析[9，10]。與GC-IRMS同位素質譜技術相比， LC-IRMS同位素質譜技術可應用于非揮發性有機物的測定，尤其是不需要衍生化直接進行同位素質譜分析[11]。自2004年賽默飛公司推出第一款市場化的LC與IRMS串聯接口LCisoLink[12]以來，LC-IRMS同位素質譜技術開始應用于考古學、地球化學、環境科學、食品鑒定等領域。McCullagh等[13]采用LC-IRMS檢測人和動物骨頭中氨基酸的δ13C，利用復合型色譜柱，硫酸溶液為流動相，室溫條件下分離15種氨基酸，IRMS測定氨基酸的δ13C，最終重現古代人和動物的飲食結構； Powers等[14]運用LC-IRMS檢測天然水中碳同位素比，以此定量分析水體中溶解無機碳含量，以及水體中溶解有機碳光化學作用的轉化率。Basler等[15]利用LC-IRMS檢測土壤中單糖的δ13C，通過單糖碳同位素比探討土壤不同碳水化合物動態變化； Cabaero等[16]運用LC-IRMS檢測蜂蜜中蔗糖、果糖和葡糖糖的δ13C，結合EA-IRMS檢測蜂蜜中蛋白質的δ13C，鑒別C3植物蜂蜜是否摻雜C4植物糖。盡管LC-IRMS同位素質譜技術已在地球科學和食品科學領域得到應用，但是LC-IRMS同位素質譜技術在應用中仍然存在很大問題，如色譜流動相必須為純水體系、 不能用有機流動相、 液相色譜柱選擇受限，嚴重影響LC-IRMS同位素質譜技術的實際應用。

為了克服LC-IRMS同位素質譜技術必須采用水相流動相而導致色譜分離洗脫能力低的問題，研究者通過提高色譜柱柱溫的方式增大水溶液的洗脫效率。Godin等[17]首先將此方法用于LC-IRMS中，利用磺化聚苯乙烯-苯二乙烯聚合柱和多孔石墨化柱兩根色譜柱高溫分離對香豆酸和阿魏酸等酚酸化合物，聚合柱溫度保持在90℃，多孔石墨化柱最高溫度升至170℃，IRMS測定酚酸特定化合物的δ13C。 Zhang等[18]在150～200℃高溫條件下，采用Xbridge、Acquity、Triart和Zirchrom PBD等不同廠家反相C18色譜柱，以純水為流動相，分離苯酚和咖啡因等化合物，用IRMS檢測這些特定化合物的δ13C。Kujawinski等[19]利用LC-IRMS檢測磺胺類藥物的δ13C，選擇Xbridge C18色譜柱，柱溫60～100℃，磷酸鹽緩沖溶液為流動相，洗脫磺胺類藥物。研究表明，反相C18色譜柱在高溫純水流動相條件下，色譜峰擴展甚至趨于扁平，C18色譜柱不能長時間在高溫條件下使用[20，21]。

20世紀60年代，科研人員通過放射性碳同位素分析鑒別飲料中咖啡因天然或人工合成來源[22]。2003年， Richling等[24]利用EA-IRMS離線檢測瓜拉納飲料、茶葉、咖啡飲料咖啡因的δ13C，樣品首先通過分析型液相色譜儀分離提取獲得的咖啡因單體化合物，純咖啡因化合物引入EA-IRMS同位素質譜儀，測定獲得咖啡因的δ13C，從而鑒別飲料中咖啡因是否為天然來源。2012年，Zhang等[18，24]利用LC-IRMS同位素質譜儀在線檢測飲料中咖啡因的δ13C，選擇Xbridge C18色譜柱，柱溫30～180℃，檢測咖啡因的δ13C。本研究基于高溫液相色譜聯用LC-IRMS同位素質譜技術[17，18]，探討LC-IRMS同位素質譜在線檢測咖啡豆、咖啡飲料中咖啡因的δ13C。結果表明，Xbridge C18色譜柱柱溫超過70℃后，色譜峰變寬而偏平，色譜柱壽命銳減，因此，選擇在純水流動相和恒溫條件下，以Xbridge shild RP C18色譜柱分離咖啡因，優化色譜柱的長度與粒徑，獲得最佳LC-IRMS在線分析條件，用于天然咖啡豆和咖啡飲料中咖啡因的δ13C值的測定，分析咖啡因δ13C數據，判斷咖啡飲料中咖啡因天然來源的真實性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Dionex UltiMate3000 型高效液相色譜儀、DELTA V Advantage 同位素質譜儀和 FINNIGAN LC IsoLink接口（美國 Thermo Scientific 公司）； Milli-Q 超純水儀（美國 Millipore 公司）；SW 30H 型超聲波儀（瑞士 SONO公司）；SIGMA 3-30KS 高速冷凍離心機（德國 Sigma公司）；Sartorius BT 223S天平（德國賽多利斯公司）。

咖啡因同位素標準物質為IAEA-600（δ13C=27.77‰ ± 0.04‰， 購于國際原子能機構）； Na2S2O8、 H3PO4等均為分析純（美國Sigma-Aldrich公司）； 實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm） 。

合成咖啡因樣品（1000 mg/L于甲醇，上海安譜公司）；咖啡豆樣品和飲料購于廣州市大型超市。

2.2 樣品前處理

咖啡豆用瑙碾缽研磨粉碎，準確稱量0.500 g 樣品于50 mL離心管中，加入25 mL超純水，振蕩1 min使其混合均勻，超聲提取30 min，10000 r/min離心5 min，取約1 mL上清液，過0.45 μm濾膜至1.5 mL樣品瓶，用超純水稀釋5倍，進行LC-IRMS測試。

取5 mL咖啡飲料樣品，用超純水稀釋至50 mL，10000 r/min離心5 min，取約1 mL上清液，過0.45 μm濾膜至1.5 mL樣品瓶，待LC-IRMS測試。

2.3 LC-IRMS檢測方法

液相色譜條件：使用Waters XBridge Shild RP C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm×3.5 μm）；流動相為超純水，流速400 μL/min；柱溫為50℃；進樣量10 μL。

LC-IsoLink氣液分離條件：樣品從LC色譜洗脫分離出來，在氧化反應管中與4%Na2S2O8溶液和4%H3PO4溶液混合， 在98.5℃條件下，目標化合物全部氧化為CO2，經過氣液在線膜分離單元分離后導入IRMS中。

同位素質譜條件：離子源電壓為3.05 kV，電流為0.72 mA；載氣為高純氦氣，壓力為150 kPa；參考氣CO2壓力為190 kPa；真空度1.5 × 104 Pa ，法拉第杯檢測器接收質量數為44、45和46目標離子。

2.4 δ13C值的計算方法

樣品測定時，每個樣品的分析起始階段和結尾階段通入高純CO2參考氣體作為內標，然后用已知δ13C值的咖啡因標準溶液標定高純CO2參考氣體的δ13C，再以CO2參考氣體的δ13C值為標準，對樣品中咖啡因的δ13C值進行計算。采用Isodat3.0軟件對數據進行分析。

咖啡因標準溶液的δ13C的計算基于國際標準物質VPDB，計算公式為[25]：

2.5 統計分析

采用Origin 8.5 軟件（美國 OriginLab公司）分析咖啡樣品檢測所得的δ13C數據，咖啡、咖啡豆、生咖啡豆、咖啡粉和咖啡飲料等不同類別樣品的咖啡因δ13C利用SIMCA 14.0軟件（瑞士 Umetrics公司）進行主成分分析。

3 結果與討論

3.1 分離條件優化

3.1.1 色譜柱的選擇 LC-IRMS同位素質譜分析中，液相色譜柱的選擇是關鍵因素，文獻[26]研究了XBridge BEH C18、Acquity UPLC BEH、Triart C18和Zirchrom共4種型號液相色譜柱， 在高溫純水流動相條件下，其中Waters公司的XBridge C18的色譜柱對樣品中δ13C值的測定影響最小。本研究選擇XBridge BEH C18和Xbridge shild RP C18兩種類型的色譜柱分離咖啡豆及咖啡飲料中咖啡因，比較不同長度以及填料粒徑（XBridge BEH C18 （50 mm × 2.1 mm， 2.5 μm）、XBridge BEH C18 （50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）、 XBridge BEH C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm） 和XBridge shild RP C18 （50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm） ）4種規格的色譜柱。結果表明，4種規格色譜柱均能實現咖啡因的分離。柱溫恒定條件下，選擇XBridge BEH C18色譜柱 （50 mm × 2.1 mm， 2.5 μm）分離咖啡因時，系統壓力過大，連續檢測樣品時，常發生壓力過大導致液相泵停止工作的情況；XBridge BEH C18（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）和XBridge BEH C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）分離咖啡因時，咖啡因保留時間較長，尤其是后者，色譜分離時間甚長，批量檢測樣品耗時，影響樣品檢測效率。Xbridge shild RB C18類型色譜柱適合純水流動相體系，色譜分離水溶性化合物分離度高，保留時間短。因此，選擇XBridge shild RP C18 色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）在恒溫純水流動條件下分離咖啡因 （圖1）。

3.1.2 流速與柱溫的選擇 LC-IRMS同位素質譜測定目標化合物的穩定碳同位素比，要求色譜流動相不含甲醇或乙腈有機洗脫液，因此實驗選擇超純水為流動相。LC Isolink氣液分離單元允許最大流速500 μL/min，其中氧化劑和酸化劑總流速最大值為100 μL/min，因此，選擇咖啡因色譜分離流動相流速為400 μL/min。

高溫條件下，純水可以達到甲醇和乙腈有機溶劑的洗脫能力[27]，因此通過提高純水流動相的色譜柱柱溫，實現咖啡因目標物的分離。XBridge shild RP C18耐受最高溫度為60℃，柱溫選擇50℃，以純水流動相分離咖啡因目標物，長時間使用后，咖啡因同位素質譜目標峰未變寬。因此，LC-IRMS檢測咖啡因的δ13C分析條件為： XBridge shild RP C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）、柱溫50℃，純水為流動相。

3.2 天然咖啡因同位素質譜分析

從市場隨機購買44種咖啡豆與咖啡樣品，分別是18種咖啡飲品、11種咖啡豆、7種生咖啡豆和8種咖啡粉，用LC-IRMS同位素質譜分析，咖啡因的δ13C值測定結果見表1。咖啡豆及咖啡天然來源的咖啡因δ13C值范圍在25.3‰～30.9‰之間，利用t分布統計學分析44種樣品的咖啡因δ13C平均值27.9‰， 標準偏差s=1.3‰。同時檢測人工合成咖啡因的δ13C值在35.8‰～38.5‰之間。Weinkauff等[22]采用EA-IRMS 檢測天然來源茶葉咖啡因，δ13C值在27.7‰～31.7‰之間，天然來源咖啡中咖啡因的δ13C值在26.5‰～27.5‰之間，天然來源瓜拉納種子中咖啡因的δ13C值在26.7‰～28.7‰之間，人工合成咖啡因的δ13C值在37.9 ‰～40.0‰之間。因此，本方法檢測天然來源及人工合成咖啡因咖啡因的δ13C數據與文獻[22]報道數據一致。

由圖2可知，咖啡、咖啡豆、咖啡粉和生咖啡豆中咖啡因的δ13C值在2倍標準偏差范圍之內，生咖啡豆或烘烤不同類別樣品中咖啡因保持一定穩定性。因此，可以根據天然來源咖啡產品的咖啡因δ13C值分布規律鑒別咖啡飲料中咖啡因是否來源于天然咖啡豆。

3.3 咖啡飲料中咖啡因的測定

采用建立的LC-IRMS同位素質譜測定咖啡因的δ13C分析方法，測定市售的16種咖啡飲料中咖啡因的δ13C（表2）。由表2可知，16種咖啡飲料中咖啡因δ13C值與咖啡豆、咖啡等天然來源咖啡因δ13C值比較相一致，咖啡因δ13C值在1倍標準偏差下限值范圍之內，其中只有1種香濃咖啡飲料的咖啡因δ13C值為31.7‰， δ13C值在咖啡豆、咖啡等天然來源咖啡因的1倍標準偏差和3倍標準偏差之間，接近3倍標準偏差下限臨界值（31.8‰），人工成咖啡因δ13C值在35.8‰以下，推斷此香濃咖啡飲料中咖啡因是非咖啡豆天然來源的咖啡因。

將44個樣品分為咖啡豆、咖啡粉、生咖啡豆和咖啡4種天然來源產品，以及1種咖啡飲料產品，LC-IRMS測試所得咖啡因δ13C值按照5種類別產品類別進行主成分分析（圖3）。由主成分分析結果可知，不同類別咖啡產品的咖啡因δ13C值相對聚集，其中咖啡豆、生咖啡豆和咖啡3種產品相對聚集在一起，咖啡粉與咖啡飲料2種類別產品聚集在一起，由此推測，咖啡飲料為糊狀懸浮液與咖啡粉產品加工工藝程序比較接近，碳穩定同位素分餾效應相似，導致它們咖啡因的δ13C值相對分布集中。

4 結 論

建立了LC-IRMS同位素質譜直接測定咖啡因δ13C值的分析方法，用于咖啡、咖啡豆天然來源咖啡因和咖啡飲料中咖啡因的測定。以天然來源咖啡因的δ13C值分布范圍為依據，用于鑒別咖啡飲料中咖啡因是否為天然來源。LC-IRMS同位素質譜技術在食品溯源及品質鑒定中具有良好的應用前景。

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