液相色譜—串聯質譜前驅離子掃描非靶向篩查鹵代有機物

王昆 黃新文 林坤德

摘 要 建立了液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）前驅離子掃描（PIS）非靶向篩查鹵代有機物的分析方法。鹵代有機物在PIS分析中產生的鹵素碎片離子能通過PIS Q3預設的質核比通道（m/z 35、37、79、81和127），根據通過的質核比通道可判斷鹵代有機物種類，并獲取其分子離子質核比信息，而非鹵代有機物無法通過PIS Q3的篩選。當Q2碰撞能為50 eV時，PIS對鹵代有機物具有較高的靈敏度。利用伯努利概型總結了不同鹵代有機物的理論同位素峰數量和豐度比的規律，結合PIS分析結果可判斷有機物攜帶鹵素原子數量。本方法成功應用于實驗室樣品和海水中鹵代有機物的篩查，未來有望用于其它環境樣品中鹵代有機物的快速篩檢。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜； 前驅離子掃描； 鹵代有機物； 同位素豐度比

1 引 言

鹵代有機物不僅在自然界中分布廣泛，而且對生態系統安全、人類健康有較大的威脅[1]。截至2015年，僅天然鹵代有機物就已被發現逾5000余種[2]。部分鹵代有機物被證實是環境激素類物質[3]。其中，鹵代脂肪烴、多氯聯苯、氯代苯酚、含氯農藥等多種鹵代有機物被美國環保局列為“優先控制污染物”[4]。鹵代有機物在自然環境中性質穩定，能長時間殘留于水、土壤和底泥中[5]。隨著環境中檢出的鹵代有機物種類不斷增加，其環境化學行為、控制方法及生態毒理效應備受關注，而建立準確、高效的鹵代有機物分析方法則是進行上述研究的基礎。基于液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）和氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）的鹵代有機物定量分析方法[6，7]雖然靈敏度高，但通常是針對某種或某類物質，且不具備非靶向篩查能力，導致許多未知鹵代有機物無法被及時發現。因此，亟需建立快速、簡單的鹵代有機物篩查方法。

許多研究已經利用GC-MS、GC×GC-TOF MS檢測未知鹵代有機物[8，9]，但現行的大部分非靶向篩查方法對極性鹵代有機物不具備特異性。基于LC-MS/MS前驅離子掃描（PIS）的分析方法因其能根據目標物攜帶的特征基團進行非靶向篩查[10～15]而備受關注。Zhang等[11]利用LC-MS/MS的PIS建立了一種飲用水中極性溴代有機物的篩查方法，成功用于飲用水中溴代消毒副產物的篩查。李歡等[14]采用PIS法篩查了溴代苯酚類物質在氯消毒過程中生成的溴代中間產物，發現了一組具有五元環結構的新型消毒副產物三鹵代-羥基環戊烯二酮。目前，關于LC-MS/MS的PIS單次進樣實現混合鹵代有機物的非靶向篩查尚未見報道，值得進行研究。

PIS模式的具體工作原理如下[16]：當PIS Q3 設為m/z 79時，LC-MS/MS的質量分析器Q3只能通過m/z=79的碎片離子。假設未知樣品中有含Br的X物質和不含Br的Y物質，兩種物質通過離子源電離后形成對應的分子離子X和Y。X和Y依次通過質量分析器Q1時，Q1能夠記錄其m/z大小。隨后進入碰撞活化室Q2與氮氣（或氦氣）發生碰撞，產生碎片離子。由于X含有Br原子，可產生79Br

和81Br碎片，m/z 79的79Br碎片可通過Q3篩選，在檢測器中產生信號，并在PIS譜圖中顯示其分子離子大小。而Y在Q2碰撞過程中不產生含Br碎片，無法通過Q3篩選，故不會產生信號。由于Br存在天然穩定同位素79Br和81Br，當待測物質在PIS Q3 m/z 79和81下同時產生信號，且結果能反映79Br和81Br的豐度比為1∶1，則認為有溴代有機物檢出。同理，當待測物質在PIS Q3 m/z 35和37下同時產生響應，且結果能反映35Cl和37Cl豐度比為3∶1，則可認為有氯代有機物檢出。 PIS Q3 m/z 127下產生信號，則認為有碘代有機物檢出。由于目前LC-QQQ MS/MS的PIS模式能實現4個PIS Q3 m/z通道的同時監控，本研究嘗試采用單次進樣實現混合鹵代化合物的非靶向篩查。

基于LC-MS/MS的PIS模式，本研究建立了一種簡單、快速的鹵代有機物篩查方法，結合伯努利概型計算不同鹵代化合物的同位素峰數量及理論豐度比，判斷鹵代化合物中鹵素原子的取代個數。本方法成功應用于氯過氧化物酶（CPO）催化生成鹵代咔唑以及海水中鹵代有機物的篩查。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Infinity 1290型LC-G6490A型QQQ MS/MS（美國Agilent公司）； N-EVAP-111氮吹濃縮儀（美國Organomation公司）； 固相萃取（SPE）裝置（上海CNW公司）； KD-300DA數控超聲波清洗機（昆山超聲儀器公司）。

乙腈、甲醇、正己烷、甲基叔丁基醚（色譜純，美國Tedia公司）； 甲酸（分析純，汕頭西隴化工公司）； 3-溴咔唑（>97%）、3，6-二溴咔唑（>97%）、3，6-二氯咔唑、己烯雌酚（≥99%）、雌二醇（98%）、己烷雌酚（≥98%），購自美國Sigma-Aldrich公司； 1，3，6-三溴咔唑（>98%）、3-氯咔唑（>98%）、1-溴-3，6-二氯咔唑（>98%）、1，3，6，8-四氯咔唑（>98%）、2，3，6，8-四氯咔唑（>98%），購自加拿大Wellington實驗室； 雌三醇（>98%，上海百靈威科技公司）； 苯丙酸諾龍（99%，武漢貝爾卡生物醫藥有限公司）； 填料量為500 mg的Oasis HLB SPE柱（美國Waters公司）； 0.22 μm PTFE針式過濾器（天津津騰公司）； 實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm，Milli-Q Element系統，美國Millipore公司）。

分 析 化 學第46卷

第11期王 昆等： 液相色譜-串聯質譜前驅離子掃描非靶向篩查鹵代有機物

2.2 液相色譜-串聯質譜測定參數

色譜參數：色譜柱為Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）； 流動相為水（A）-乙腈（B）； 梯度洗脫程序：0～5 min，5% B； 5～35 min，5%～95% B； 35～40 min，95% B； 40～45 min，5% B。流速為0.2 mL/min； 進樣體積為10 μL。

質譜參數分：離子源為電噴霧負離子（ESI-）模式； 分段設置為0～5 min，To waste模式； 5～45 min， To MS模式； 鞘氣溫度為350℃； 鞘氣流速為12 L/min； 干燥器溫度為300℃； 干燥器流速為16 L/min； 霧化器壓力為35 psi； 噴嘴電壓為1500 V； 毛細管電壓為4000 V； 破碎電壓380V； 碰撞氣為高純氮氣（99.999%）； PIS模式時，Q3檢測離子設為m/z 35、37、79、81或127，Q1 范圍為m/z 100～700，碰撞能為50 eV； 全掃描模式時，范圍為m/z 100～700。

2.3 實際樣品的采集和預處理

2.3.1 CPO催化生成鹵代咔唑實驗和預處理 實驗方法參照文獻[17]。分別取20 μL一定濃度的咔唑標準使用液于1.5 mL Agilent進樣瓶中，依次加入100 mmol/L pH 3.0 NaH2PO4/H3PO4緩沖溶液、不同濃度的NaX溶液、5 mmol/L H2O2和10 U/mL CPO，擰緊瓶蓋，渦旋振蕩混勻溶液，置于溫度為（25±1）℃的恒溫搖床中避光反應。反應總體積為0.5 mL，咔唑初始濃度為1.0 μmol/L，H2O2和CPO初始濃度分別為500 μmol/L和1 U/mL。待取樣時，向體系中加入0.5 mL正己烷-甲基叔丁基醚（90∶10， V/V）進行萃取，靜置分層后收集有機相； 重復上述操作2次，合并有機相，氮吹至干，用甲醇定容至200 μL后直接分析。

2.3.2 海水的采集和預處理 2017年6月，在廈門西海域九龍江入海口2個采樣站位（A和B）采集表層水樣。采集的水樣用1 L鋁箔紙包裹的玻璃瓶盛裝，避光保存運輸。樣品預處理采用水樣中多種有機物同時分析方法[18]，具體操作如下：采用甲醇和超純水活化HLB固相萃取柱，500 mL待測水樣以4～6 mL/min的流速勻速通過HLB柱。上樣完畢后，先用6 mL甲醇-水（5∶95，V/V）對HLB柱進行清洗，抽干后，依次用8 mL甲醇、4 mL甲醇-二氯甲烷（50∶50，V/V）洗脫，收集洗脫液，40℃下氮吹，最后用甲醇-水（20∶80，V/V）定容至1.0 mL，經0.22 μm PVDF濾膜過濾后直接分析。

3 結果與討論

3.1 碰撞能的優化

實現PIS分析的核心是利用碰撞活化室Q2的高純氮氣（或氦氣）對待測物質進行碎片化，再篩選出目標m/z。碰撞能越大，待測物質碎片化程度越高，而過高碰撞能會使目標碎片離子進一步破碎。為考察碰撞能的影響，選擇5種碰撞能（5、20、35、50和70 eV）進行比較。由圖1可見，當碰撞能從5 eV增大至35 eV，鹵代有機物的響應不斷增強，但隨著碰撞能的繼續增加，儀器響應趨于穩定，說明碰撞能升高可增加鹵代有機物母離子的碎片化，有利于獲得Cl和Br碎片。為避免長時間使用高碰撞能對MS壽命的負面影響，后續實驗將碰撞能設為50 eV。

3.2 PIS與全掃描模式的比較

向50 μg/L鹵代咔唑混合標準品中摻入等濃度的6種雌激素（非鹵代有機化合物）作為干擾物質，比較PIS和全掃描兩種分析模式對鹵代咔唑的篩查效果，結果如圖2所示。

由圖2A可見，全掃描模式的總離子流圖涵蓋了包括干擾物質和鹵代有機物在內的所有有機物，不具有選擇性。另外，當流動相變為高比例有機相（即35～42 min）時，全掃描模式的基線漂移明顯，噪聲增加，分析時需注意目標物是否被掩蓋； 相比之下，PIS的基線平穩，僅有鹵代咔唑出峰，能直接排除干擾物質，后期分析工作量小。

以保留時間（RT）32.05 min的MS圖為例（圖2B），比較了相同保留時間PIS和全掃描模式的m/z干擾情況。在4個PIS Q3 m/z的MS圖中，m/z 314.5附近均能觀察到一簇同位素峰，且滿足一定豐度比規律，由此推斷該物質為混合鹵代有機物。4張PIS Q3 m/z MS圖幾乎觀察不到其它m/z的干擾，而全掃描的MS圖中存在m/z為146.9、197.7、225.9、243.9等眾多干擾峰，增加了后期分析的難度。

由此可見，全掃描模式不具備選擇性，可以獲得更多樣品信息，但同時存在背景干擾較大等不足，數據處理階段需逐一進行甄別，工作量較大； 而PIS模式可根據實際需求，改變PIS Q3的m/z值，調整篩查范圍，在篩查攜帶特征官能團有機物時能取得較好的效果，具有靈活、工作量小等優點。

3.3 PIS分析中氯、溴取代有機物理論同位素峰數及其豐度

在質譜分析中，同位素峰的個數和相對豐度是判斷待測物質中鹵代個數的重要依據。在自然環境中，35Cl和37Cl豐度比約為3∶1，79Br和81Br豐度比約為1∶1，而I元素的幾種天然同位素自然含量差異較大。QQQ這類三重四極桿質譜不能準確測量同位素豐度和豐度比值，低豐度的同位素常被背景噪聲掩蓋，因此不能根據圖譜中的同位素峰數及其豐度關系判斷I等同位素豐度差異較大的元素的取代數量。

由于Cl、Br兩種元素都只存在兩種天然同位素，每個取代位上的鹵素是輕同位素或重同位素互不影響，所以是相互獨立事件，因此質譜分析中同位素峰的豐度關系可用伯努利概型計算。以Br為例，若將待測物質的N個同位素峰按m/z從小到大排列，第k個峰代表該物質的N個Br原子中含有k個81Br， 且任一取代位上79Br的概率p79為0.5，81Br的概率p81也為0.5，那么該同位素峰的豐度概率為：

各個同位素峰的概率比值就是該物質同位素峰豐度之比。反過來，實際實驗也可通過同位素峰個數及豐度比判斷Cl、Br原子的取代數量。

全掃描模式中，含m個Br原子和n個Cl原子的物質在質譜圖中會對應產生m+n+1個同位素峰，但實際實驗中發現，PIS模式的m/z僅有m+n個同位素峰，相對豐度規律也與全掃描存在不同。下面從純鹵代、氯溴混合取代兩種情況，比較PIS模式與全掃描模式的豐度比差異。

3.3.1 純鹵代化合物 以Q3檢測的質荷比設定為m/z 79為例，介紹純溴代化合物理論豐度比的計算過程。當含N個Br原子的目標物的Br原子均為79Br時，其相對分子質量為M。假設該物質進行LC-MS/MS PIS模式分析，則會產生N個同位素峰。若將N個同位素峰按m/z值從小到大排列，第k個峰應含有k-1個81Br原子（1≤k≤N），那么該峰對應的物質相對分子質量為M+2k-2，且含有N-k+1個79Br原子，記為事件A。事件A發生概率可用伯努利概型進行計算，其概率為：

由于全掃描模式中第k個峰對應物質的所有Br原子都被檢測，各個同位素峰之間不存在差異，因此常忽略該部分計算； 而PIS模式中，第k個峰對應物質的N個Br原子僅N-k+1個被檢測，因此該峰在儀器上產生的響應是全掃描響應的N-k+1N。

因此該同位素的豐度為

將N=1、2、3等整數依次帶入算式，可以計算獲得不同溴代個數有機物的同位素峰的理論豐度比，列于表1。同理，也計算了PIS Q3 m/z設定為81的理論豐度比。

純氯代有機物也可采用該方法進行計算。不同的是，Cl原子的兩種同位素豐度比為3∶1，化合物任一取代位上35Cl的概率p35為0.75，37Cl的概率p37為0.25。具體結果列于表2。

3.3.2 混合鹵代化合物 以PIS Q3 m/z設為 79為例，介紹混鹵代化合物理論豐度比的計算過程。假設目標物質攜帶N個Br原子、H個Cl原子，同時當N個Br原子均為79Br，H個Cl原子均為35Cl時，其相對分子質量為M。該目標物在PIS Q3 m/z 79下將產生N+H個同位素峰，且N個Br原子中至少含有1個79Br。任一同位素對應的物質攜帶n個81Br原子，h個37Cl原子，那么該物質也攜帶N-n個79Br原子，H-h個35Cl原子。將同位素峰按m/z順序從小到大排列，該同位素情況將位于從小到大的第k個峰（1≤k≤N+H），且始終滿足n+h=k-1。

將N=1、2、3等整數，H=1、2、3等整數依次帶入算式，可以計算獲得不同混合鹵代有機物的同位素峰的理論豐度比，列于表3。

3.4 方法的應用

3.4.1 篩查CPO催化咔唑生成的鹵代產物 用本方法篩查CPO催化鹵代咔唑反應過程中的鹵代產物，再借助子離子模式對中間產物進行碎片分析，結果如圖3和圖4所示。由圖3A可見，當鹵素離子僅為5 μmol/L I時，反應時間為0和16 min的樣品中均僅有溶劑峰出現； 而在反應時間為240 min的樣品中，RT=5.52 min處有明顯的色譜峰，此物質的m/z=291.8。當I濃度升高至50 μmol/L時，反應時間為16和240 min樣品在RT=5.52和7.87 min均有物質檢出，m/z分別為291.8和417.7（圖3B）。根據待測物質在子離子模式下產生的結構碎片及其在PIS Q3 m/z下的出峰情況進行初步鑒定，推測兩種物質分別為一碘代咔唑和二碘代咔唑，如圖3C～3F所示。雖然I元素不同于Cl、Br元素，不存在豐度相近的天然同位素，但在子離子模式測定中，碘代有機物的譜圖中能觀察到I原子丟失后的碎片峰，也能判斷物質的碘代數量。

鑒于LC-MS/MS的PIS能完成4個PIS Q3 m/z的同時監測，本研究嘗試同時進行兩種鹵代有機物（Cl/Br、Br/I或Cl/I）的組合篩查。將CPO催化反應體系的鹵離子調整為Br、I混合，且I和Br初始濃度分別為50和1 mmol/L。當反應時間為0 min時無目標物檢出； 而當反應時間為16 min（圖4A）和240 min（圖4B）時，篩出目標物數量分別為6和5種。隨后，對捕獲的目標物逐一進行初步鑒定，這8種鹵代咔唑分別是-I、-I2、-I3、-Br、-Br2、-Br3、-IBr和-IBr。以RT=7.25 min的中間產物為例（圖4C和4D），對鑒定過程進行簡單介紹。PIS Q3 m/z 127下能觀察到一組m/z 370.8/372.8的同位素峰，在PIS Q3 m/z 79和81下各觀察到一個同位素峰，m/z分別為370.8和372.8，且同位素豐度比均為1∶1，說明此物質含有一個Br原子和至少一個I原子。再通過解析其在子離子模式下產生的碎片，發現此物質有且僅有一個I原子，故推測該物質為一溴一碘混合鹵代咔唑。

根據文獻[17，19]的GC-TOF MS和GC-MS分析結果，在僅含Br的反應體系中，CPO能夠催化咔唑先后生成一溴取代咔唑、二溴取代咔唑等溴代咔唑，而在Br、Cl混合的反應體系中，CPO既能催化咔唑生成單鹵代咔唑，也能生成混合鹵代咔唑，這與本研究的篩查結果一致。

3.4.2 篩查海水中的鹵代有機物 環境水體中的鹵代有機物不僅種類繁多，結構和性質差異明顯，濃度水平普遍較低（ng/L級別甚至更低），因此采用PIS模式分析前須對水環境樣品中的有機物進行富集。富集方法參照水樣多種有機物同時分析前處理方法[18]，選擇寬極性范圍的Oasis HLB柱作為富集材料，對水環境樣品中有機物質進行富集。在PIS Q3 m/z設為35、37時，站位A、B采集的樣品均無目標物檢出； 而當PIS Q3 m/z設為79、81時，A站位可以篩查到溴代有機物，站點B無檢出（圖5A和5B）。根據目標物在PIS下的m/z情況，發現A站位檢出的兩種溴代有機物分別為二溴代有機物（圖5C）和三溴代有機物（圖5D），但由于樣品濃度較低、缺少其它特征碎片離子作輔助定性、質譜分辨率有限等原因，無法進一步推測其詳細結構。Zhang等[11]在建立PIS模式篩查極性溴代有機物方法時，直接進樣，并未選擇色譜作為前端分離手段。但由圖5可見，在PIS Q3 m/z 79的通道上存在一定的儀器干擾或環境基底干擾，若不采用色譜進行分離，可能造成樣品假陽性。未來的實際應用中，仍需將色譜和PIS結合使用，以達到最佳分析效果。

References

1 JIN Li-Juan， CHEN Bao-Liang. Prog. Chem.， 2017， 29（9）： 1093-1114

金梨娟， 陳寶梁. 化學進展， 2017， 29（9）： 1093-1114

2 Gribble G W. Environ. Chem.， 2015， 12（4）： 396-405

3 Katsoyiannis A， Samara C. Environ. Res.， 2005， 97（3）： 245-257

4 Keith L，Telliard W. Environ. Sci. Technol.， 1979， 13（4）： 416-423

5 Bigot M， Hawker D W， Cropp R， Muir D C G， Jensen B， Bossi R， Nash S M B. Environ. Sci. Technol.， 2017， 51（16）： 8944-8952

6 Dofour P， Pirard C， Charlier C. J. Chromatogr. B， 2016， 1036-1037： 66-75

7 Chi X Y， Liu J Y， Yu M，Xie Z Q， Jiang G B. Talanta， 2017， 164： 57-63

8 Hauler C， Vetter W. Rapid Commun Mass Spectrom.， 2015， 29（7）： 619-628

9 Ubukata M， Jobst K J， Reiner E J， Reichenbach S E， Tao Q P， Hang J L， Wu Z P， Dane A J， Cody R B. J. Chromatogr. A， 2015， 1395： 152-159

10 Steen H，Kuster B， Fernandez M， Pandey A， Mann M. Anal. Chem.， 2001， 73（7）： 1440-1448

11 Zhang X R， Talley J W， Boggess B， Ding G， Birdsell D. Environ. Sci. Technol.， 2008， 42（17）： 6598-6603

12 Liu P， Huang Y Q，Cai W J， Yuan B F， Feng Y Q. Anal. Chem.， 2014， 86（19）： 9765-9773

13 Crevelin E J， Possato B， Lopes J LC， Lopes N P， Crotti A E M. Anal. Chem.， 2017， 89（7）： 3929-3936

14 LI Huan， LI Zheng-Kui， LI Ai-Ming， ZHOU Qing， WANG Ying， PAN Yang. Environ. Sci.， 2017， 38（8）： 3273-3280

李 歡， 李正魁， 李愛民， 周 慶， 王 瑩， 潘 旸. 環境科學， 2017， 38（8）： 3273-3280

15 Du L L， Xue Y， Xie J. Chromatographia， 2018， 81（5）： 769-776

16 Pan Y， Zhang X. Environ. Sci. Technol.， 2013， 47（3）： 1265-1273

17 Chen Y Q， Lin K D， Chen D， Wang K， Zhou W X， Wu Y， Huang X W. Environ. Pollut.， 2018， 232： 264-273

18 LIN Shan-Shan， YI Qi-Tong， HONG Jia-Jun， CHEN Meng， YUAN Dong-Xing. Chinese Journal of Chromatography， 2013， 31（10）： 980-988

林姍姍， 易啟同， 洪家俊， 陳 猛， 袁東星. 色譜， 2013， 31（10）： 980-988

19 Mumbo J， Lenoir D， Henkelmann B， Schramm K W. Environ. Sci. Pollut. Res.， 2013， 20（12）： 8996-9005