曲克蘆丁腦蛋白水解物對大腦中動脈栓塞后大鼠神經血管單元的保護作用

曾靜，王茹，李丹丹，趙弘軼，張微微，黃勇華

卒中是導致人類死亡和致殘的首要原因之一，嚴重威脅著人類的健康[1]。針對卒中的治療，研究人員進行了大量的臨床前研究，并取得了很多引人注目的成果，但用于臨床治療時，大多數研究的有效性和安全性都是值得懷疑的。近年來，關于卒中的研究集中于治療神經血管單元（neurovascular unit，NVU），能夠恢復NVU的整體功能是國內外專家普遍認可的有效治療策略的關鍵。NVU的概念最早由LO等[2]提出，是一種結構和功能相對獨立的多細胞復合體，由神經元、星形膠質細胞、微血管內皮細胞、周細胞及細胞外基質等細胞組分構成[3]，調節NVU各組分之間的相互作用，維持微環境的動態平衡，從而維持神經元正常的功能[4]。

曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液是曲克蘆丁與豬腦提取物制成的復方制劑，具有抑制紅細胞和血小板聚集、防止血栓形成、改善微循環、增加血中氧的含量、促進血管生成等作用[5]。曲克蘆丁用于急性腦梗死的治療已有30多年的歷史，但多數是與其他藥物如依達拉奉等聯用協同治療急性腦梗死[6]，且其作用機制還不十分清楚。

Longa法制備大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是目前國內外廣泛采用的局灶性腦缺血動物模型之一[7]，其效果與人類卒中的臨床表現接近。本次實驗采用Longa線栓法制備大鼠局灶性腦缺血動物模型，通過神經功能缺損評分、蛋白質印跡法、免疫熒光、7.0T磁共振成像技術等方法，評價曲克蘆丁腦蛋白水解物對神經血管單元的保護作用，并探討其保護作用可能的機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及材料 120只雄性清潔級SD大鼠，體重（250±20）g，購于北京斯貝福實驗動物中心。曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液（吉林四環制藥有限公司，產品批號：國藥準字H22026572，以下簡稱“曲克蘆丁”）。兔抗血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗體（sc-14014，SANTA CRUZ，內皮細胞標記分子），兔抗Occludin多克隆抗體（sc-5562，SANTA CRUZ，緊密連接標記分子），小鼠抗基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）單克隆抗體（sc-393859，SANTA CRUZ），兔抗膠質纖維酸性蛋白[（glial fibrillary acidic protein，GFAP）；ab33922，abcam，星形膠質細胞標記分子]，小鼠抗誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）單克隆抗體（ab49999，abcam），兔抗3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）單克隆抗體（N 0409，SIGMA），兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（GB11002，谷歌生物），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽[（4’，6-diamidine-2-phenyl indole，DAPI）；C0060，Solarbio]，尼氏染色液（C0117，碧云天），硅膠栓線80根（北京西濃科技有限公司）。

1.2 實驗分組及模型制作 將120只雄性SD大鼠采用隨機數字表法分成假手術（SHAM）組（n=40）、MCAO組（n=40）以及MCAO+曲克蘆丁治療組（n=40）。參照Longa法制備MCAO動物模型，大致步驟如下：10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，將麻醉完全后的大鼠仰臥位固定于實驗臺上，沿頸部正中線切開，小心分離左側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，結扎頸總動脈近心端及頸外動脈，動脈夾暫時夾閉頸內動脈，在距離頸總動脈分叉處約2 mm處剪開一個小口，從此處將硅膠栓線插入頸總動脈、頸內動脈直至大腦中動脈開口處。假手術組：僅分離頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈。

1.3 分組處理 MCAO+曲克蘆丁治療組于術后立即給予曲克蘆丁3 ml/kg，1次/日腹腔注射3 d，MCAO組和假手術組均給予等量生理鹽水腹腔注射。所有大鼠均置于適宜的溫度和濕度環境中，自由飲水，自由取食。

1.4 行為學檢測 參照CHEN等[8]的改良神經功能缺損評分（modified Neurological Severity Score，mNSS），每組取10只大鼠，分別于栓塞后3 d、7 d、14 d進行行為學檢測。mNSS包括運動、感覺、反射和平衡4個方面內容，共18分，得分越高，神經功能缺損越嚴重。

1.5 磁共振成像 栓塞后3 d對進行mNSS評分的所有大鼠進行7.0T高分辨率磁共振掃描（首都醫科大學實驗室），取T2序列及動脈自旋標記（arterial spin label，ASL）序列分別反應梗死的區域及血流情況。

1.6 尼氏染色 栓塞后3 d，每組取10只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，經心臟依次灌注300 ml生理鹽水及300 ml 4%多聚甲醛溶液，完整取出腦組織，依次放入4%多聚甲醛溶液、20%蔗糖、30%蔗糖中浸泡各6 h，進行冰凍切片。取各組相同部位的腦片行尼氏染色，觀察神經元的數量及形態變化。

1.7 免疫熒光 從上述準備完畢的腦片中，分別取各組對應部位的腦片進行免疫熒光染色，一抗為內皮細胞、星形膠質細胞、緊密連接的標記物vWF（1∶100）、GFAP（1∶1000）及Occludin（1∶100），二抗為Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG（H+L）（碧云天，1∶500），采用DAPI對細胞核進行染色。染色結束后利用熒光顯微鏡進行拍照，然后利用Photoshop軟件進行計數，對于處于圖片邊界線上的標記物，只計數在上線和左線者，對于一團熒光標記物，按單個計數，然后計算各組平均值±標準差。

1.8 蛋白印跡法 栓塞后3 d，每組各取10只大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速斷頭取出整個大腦，各組取左側大腦中動脈供血區相同大小的腦組織，置于液氮中保存，待各組取材完畢后或者需要時進行蛋白提取，盡量各組同一批提取，避免操作步驟的微小差異影響實驗結果。然后進行蛋白電泳，一抗為iNOS（1∶1000）、MMP-9（1∶200）、3-NT（1∶1000）以及內參GAPDH（1∶2000），二抗為辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔的IgG（Abmart，1∶4000）和HRP標記的山羊抗小鼠IgG（谷歌生物，1∶4000）。具體步驟不再贅述。抗體孵育結束后利用BIO-RAD ChemiDoc XRS+ Software進行顯色，然后采用Image J圖像分析軟件對顯色結果進行灰度分析，計算各組平均值±標準差。

1.9 統計學分析 采用SPSS 19.0分析軟件進行統計學分析，計量資料采用表示，組間樣本均數的比較采用單因素方差分析。P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學改變 分別于術后3 d、7 d、14 d，每組隨機取10只大鼠進行mNSS評分，結果顯示，MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組相比，神經功能缺損評分明顯降低（P3d＜0.05，P7d＜0.01，P14d＜0.01），比較差異有統計學意義（表1和圖1）。

2.2 磁共振成像 大腦中動脈栓塞后栓塞區域在T2序列上呈高信號，在ASL序列上血流信號明顯減低，MCAO+曲克蘆丁治療組較MCAO組在T2序列上未見明顯差異，而在ASL序列上血流信號明顯增強，血流增加（圖2）。

2.3 曲克蘆丁對神經血管單元的保護作用 尼氏染色結果顯示（圖3），MCAO后，神經元細胞核固縮，大量空泡形成，細胞排列紊亂，存活神經元數量顯著減少。而MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組相比，上述改變明顯減輕。免疫熒光染色結果顯示（圖4），MCAO組vWF及Occludin較假手術組明顯減少，而GFAP則顯著增多；MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組比較，vWF及Occludin較多，而GFAP減少（P＜0.05）。

2.4 曲克蘆丁的作用機制 蛋白質印跡法結果顯示，MCAO后，iNOS、MMP-9的表達增加，3-NT產生增多，MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組相比，iNOS、MMP-9的表達顯著減少，3-NT產生減少（P＜0.05）（圖5）。

圖1 栓塞后3 d、7 d、14 d各組mNSS結果比較

表1 曲克蘆丁對大腦中動脈栓塞后mNSS評分的影響

圖2 栓塞后3 d三組磁共振成像

圖3 栓塞后3 d三組尼氏染色（40×10）

圖4 栓塞后3 d三組內皮細胞、星形膠質細胞、緊密連接的標記分子的免疫熒光染色

3 討論

缺血性卒中不僅損傷神經元，還損傷膠質細胞和微血管，而且這種損傷還可以通過細胞之間的相互作用損傷周圍細胞[9]。卒中后腦細胞會發生一系列病理改變，能量代謝紊亂、興奮性氨基酸活性增強、炎癥刺激、氧化應激以及凋亡等[10]。因此，僅針對一種細胞類型或局限于維持神經元功能的治療，往往不能收到滿意的效果。而更加廣泛的保護NVU的各細胞組分，可能成為卒中新的治療策略。

iNOS是一氧化氮合酶的3種亞型之一，在生理條件下很少表達，而在缺血性卒中等病理條件下卻可以大量表達[11]，其表達產物3-NT也顯著增加，而3-NT的大量形成已被證實參與了腦缺血再灌注損傷、神經退行性疾病、腦外傷等多種病理損傷過程[12]。MMP-9是一類能水解細胞外基質的金屬蛋白酶，具有降解血管基膜、激活細胞因子等多種生物活性，還參與了血腦屏障的破壞、血管動脈粥樣硬化形成、缺血性卒中出血性轉化、卒中后恢復等病理過程[13]。星形膠質細胞是中樞神經系統最常見的細胞類型，與神經元的激活以及突觸傳遞有著密切的聯系，參與腦內微環境的調節[14]。星形膠質細胞是MMP的主要來源，在很多疾病如缺血性卒中導致的神經元損傷中，MMP-2和MMP-9的表達水平顯著升高[15]，因此，星形膠質細胞增多以及MMP-9的表達增多可以作為神經元受損的標志之一。

本研究表明，曲克蘆丁可以減少MCAO后神經元凋亡，抑制星形膠質細胞活化，保護內皮細胞及血腦屏障緊密連接。之前已有研究表明，曲克蘆丁具有抑制血小板聚集、防止血栓形成的作用[5]。神經元、星形膠質細胞、微血管內皮細胞是NVU的重要組成部分，本研究第一次通過MCAO模型表明曲克蘆丁對NVU具有保護作用。

曲克蘆丁可以減輕MCAO后神經功能缺損。本研究通過對MCAO后3 d、7 d、14 d大鼠進行mNSS評分表明，曲克蘆丁能顯著減輕MCAO后神經功能缺損。

前已述及，腦缺血缺氧損傷后，iNOS、MMP-9大量表達，3-NT產生增多，本研究也證實也這個觀點。曲克蘆丁則可以抑制MCAO后iNOS、MMP-9的表達，減少3-NT的產生。

總之，本研究證明了曲克蘆丁腦蛋白水解物可能通過抑制iNOS的表達，減少3-NT、超氧化物的產生，抑制星形膠質細胞的活化增殖，減少MMP-9的產生，從而對MCAO后NVU具有保護作用。然而，本研究僅從抑制MMP表達和減輕氧化應激兩方面對曲克蘆丁作用機制進行了探索，曲克蘆丁的其他作用機制仍不清楚；此外，本研究僅從動物實驗研究曲克蘆丁的作用及機制，尚缺乏大量的臨床實驗，因此，本課題后期將更加深入地探討曲克蘆丁的作用機制，并在此基礎上進行相應的臨床研究。

圖5 栓塞后3 d三組iNOS、MMP-9、3-NT的表達情況

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