應(yīng)用高效液相色譜法檢測食品中黃曲霉毒素

□ 汪恩婷 鄒振宇 楊 皓 楊 京 重慶市計量質(zhì)量檢測研究院

黃曲霉毒素廣泛存在于各種糧油食品及堅果食品中。由于黃曲霉毒素具有極強的毒性及致癌性，長期食用含有黃曲霉毒素的食物會對人體和家畜帶來較大的危害。利用高效液色相譜法檢測黃曲霉毒素能夠顯著提高檢測的靈敏度。目前，黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)、特點、性質(zhì)等信息已經(jīng)被研究透徹，但就我國的技術(shù)條件來說，傳統(tǒng)的檢測方法達(dá)不到國際規(guī)定的要求，因此急需進行相關(guān)檢測方法的研究。

1 黃曲霉毒素的危害分析

黃曲霉毒素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似霉菌毒素，由二氫呋喃香豆素衍生而來，在氣候濕熱的一些地區(qū)的食物中容易產(chǎn)生。自然界中土壤、堅果食品及動植物種均存在黃曲霉毒素，尤其是玉米、小麥、花生等農(nóng)作物加工產(chǎn)品容易受到污染，通過食物進入人體后，對人體的危害極大。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為1類致癌物，其毒性極強，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機農(nóng)藥的毒性，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大。2016年的相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，歐盟共發(fā)出2 993份有關(guān)黃曲霉毒素的通報信息，其又產(chǎn)生7 288條跟蹤信息，比上一年增長11.1%。報告中，與我國息息相關(guān)的通報多達(dá)50條，其中關(guān)于堅果及其加工食品等中含有黃曲霉毒素的通報數(shù)量排全球第五，其中有49條通報均是關(guān)于中國生產(chǎn)的花生。由于黃曲霉毒素的廣泛性及危害性，國內(nèi)對食品中黃曲霉毒素的檢測不斷重視，但如何提高黃曲霉毒素的檢測質(zhì)量依然是一個亟待解決的問題。

2 高效液色相譜法檢測黃曲霉毒素

高效液色相譜法在黃曲霉毒素的檢測中應(yīng)用廣泛。黃曲霉毒素經(jīng)過衍生后，用高效液色相譜法與熒光檢測相結(jié)合進行檢測，檢測的效果最好、靈敏度高。檢測過程中，利用乙腈等作為流動相，并利用四元泵將緩沖液將溶劑注入色譜柱中，樣品中的不同組分經(jīng)過分離可通過檢測系統(tǒng)檢測含量。在應(yīng)用高效液色相譜法檢測時，首先用三氯甲烷、甲醇等溶劑對檢測樣本進行處理，提取出樣本中的黃曲霉毒素，通過凈化及衍生化后，置于反相色譜柱中，使用熒光檢測器對其進行全面的檢測分析。利用外標(biāo)法分析系統(tǒng)各組分的峰高及面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可準(zhǔn)確定量。試驗中，為了提高樣本的純度，減少各種雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，會將高效液色相譜法與免疫親和層析技術(shù)結(jié)合使用，從而實現(xiàn)對樣本中黃曲霉毒素的特異性和活躍性的檢測。當(dāng)黃曲霉毒素進入免疫親和柱中時，會發(fā)生免疫親和反應(yīng)，使得黃曲霉毒素被吸附在免疫親和柱中的固體支持物上。然后向柱中加入提取融合劑，其中的抗體與黃曲霉毒素融合將其提取出來。檢測結(jié)束后，使用清水就能將免疫親和柱里的樣本殘留清除干凈，然后再使用洗脫劑清除黃曲霉毒素殘留。

為了提高黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1的檢測靈敏度，可采用電化學(xué)衍生法、光化學(xué)衍生法、碘衍生法、三氟乙酸柱前衍生法等進行處理。目前，三氟乙酸柱前衍生法能實現(xiàn)較高的檢測靈敏度。將熒光檢測器與高效液色相譜法相結(jié)合，能夠達(dá)到更高的靈敏度和分辨度，使得檢測精確度提高，可用于不同類型的黃曲霉毒素檢測分析。但由于檢測流程復(fù)雜，且黃曲霉毒素種類眾多、結(jié)構(gòu)類似，因此在進行分離時需要消耗大量人力、物力資源，分離時間也較長。由于黃曲霉毒素B1、G1的檢測靈敏度相對較低，因此在實踐中，必須使用衍生化法進行處理。另外，應(yīng)用高效液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)法，精確定量、定性分析食品中的黃曲霉毒素不僅高效快捷，靈敏度也大大提高，是目前發(fā)展的主要方向。

3 檢測結(jié)果分析與探究

3.1 優(yōu)化色譜條件

通過查閱大量的實驗數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，大部分黃曲霉毒素的檢測使用甲醇或乙腈和水作為流動相。由于甲醇與水的組合形成的峰形好，出峰時間比乙腈與水的要短，因此檢測中常選用甲醇和水的組合作為流動相。當(dāng)甲醇與水的比例在45∶55時，進行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的分離效果最好。為了篩選出黃曲霉毒素B1的最佳檢測波長，經(jīng)過大量實驗數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在選擇流動相作為背景溶液、使用熒光檢測器對黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測時，使用λ ex/λ em為360 nm/450 nm的波長時，雜峰與基線噪音的干擾較少[1]。

3.2 線性關(guān)系與檢出限

使用上述的檢測方法對黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測時，以峰面積作為縱坐標(biāo)、以B1的濃度作為橫坐標(biāo)，可得出如下的回歸方程：y=3.288x+0.0127，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，根據(jù)3倍信噪比得出檢出限為1.02 μg/kg。

3.3 回收率和精確度

有實驗顯示，若取6份20 g相同大米，檢測出的黃曲霉毒素B1濃度分別為 5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg、15 μg/kg、15 μg/kg，檢測后回收率在82.4%～88.6%。若取40 μg/kg黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液進行6次平行試驗，得到峰面積分別為1 065、1 068、1 071、1 072、1 074、1 075，從而算出精確度為0.4[2]。

4 結(jié)論

黃曲霉毒素在自然中廣泛存在且危害大，為了充分保證人們的食品安全，需要探索食物中的黃曲霉毒素高效可靠的檢測方法，充分利用高效液色相譜法及相關(guān)的輔助技術(shù)，提高檢測結(jié)果的精確度和靈敏度對食品安全工作的開展具有重要的意義。