新城疫病毒抗腫瘤作用研究進展

操詹魁　王志玉

250012 濟南，山東大學公共衛生學院病毒學研究室

癌癥全球發病率近年呈上升趨勢，作為主要的死因之一，癌癥已嚴重威脅到人類健康和生命安全。常規的癌癥治療手段包括手術、放射和化療，療效值得肯定，但同時存在風險較高、副作用偏大、治愈率偏低等問題。隨著醫學技術的不斷進步，病毒、基因療法等特異性高的癌癥治療手段不斷涌現，療效也有了明顯提高。溶瘤病毒(oncolytic virus)能選擇性在腫瘤細胞中復制，可產生直接的細胞毒作用，殺傷腫瘤細胞，也可作為基因治療載體、腫瘤疫苗等進行腫瘤治療[1]。

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV) 是具有溶瘤活性的單股負鏈RNA病毒，屬副粘病毒科、副粘病毒亞科、腮腺炎病毒屬，基因組全長約15 kb，含6種結構基因(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)，分別編碼磷蛋白(phosphate protein, P)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, NP)、基質蛋白(matrix pro-tein, M)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase, HN)、融合蛋白(fusion, F)和大分子RNA聚合酶蛋白(large protein, L)[2]。NDV感染腫瘤細胞的過程需要HN和F兩種膜蛋白的參與。HN蛋白具有促細胞融合、受體識別和神經氨酸酶活性，分別在病毒識別腫瘤細胞、膜融合和暴露腫瘤細胞抗原表位的過程中發揮重要作用[3]。F蛋白具有細胞融合活性，是決定病毒毒力的關鍵，在感染腫瘤細胞過程中與HN蛋白相互作用，共同介導病毒包膜和腫瘤細胞膜融合，使核糖核蛋白復合體(ribonucleoprotein complexes, RNPs)進入腫瘤細胞，啟動病毒復制過程[4]。

禽類感染NDV后發生新城疫，表現為黏膜出血、呼吸困難等癥狀，嚴重時可導致死亡。人感染NDV后表現為輕微流感樣或結膜炎癥狀。20世紀70年代，匈牙利內科大夫Csatary[5]發現罹患胃癌的農場主在感染NDV后出現痊愈傾向，首次發現了NDV的抗腫瘤作用[6]。隨后大量的細胞、動物實驗結果證明，其對惡性腫瘤有一定的療效，溶瘤療法也因此被認為是一種新的、潛在的惡性腫瘤治療手段。近年來有學者利用反向遺傳學重組NDV病毒，使其溶瘤效果得到進一步增強[7-9]。

1　NDV的體外抗腫瘤作用

NDV感染腫瘤細胞是其發揮抗腫瘤作用的第一步，腫瘤細胞表面分布有大量的唾液酸受體，HN蛋白識別并結合腫瘤細胞表面受體后，其同源四聚體頭部上抬， 頸部與F0蛋白相互作用，水解釋放融合肽介導NDV進入腫瘤細胞，開始NDV的復制和增殖[10]。Puhler等[11]拯救出標記增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的重組NDV病毒MTH-68，感染腫瘤細胞后，熒光觀察證實MTH-68能選擇性地在腫瘤細胞中復制。其后，不斷有研究表明癌細胞相比正常細胞對NDV敏感度更高，更易凋亡，且NDV的這種殺傷效應與時間、劑量成正比[12-13]。NDV選擇性在腫瘤細胞復制并產生殺傷作用的機制可能與腫瘤細胞干擾素表達受阻有關，RNA病毒的復制會涉及雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)的合成，這種外源物質能夠誘導基于Ⅰ型干擾素干擾素-α(interferon alpha, IFN-α)、干擾素-β(interferon alpha, IFN-β)的細胞防御系統，而腫瘤細胞干擾素表達缺陷，導致病毒在腫瘤細胞中的增殖不受抑制[14]。此外，Walter等[15]在研究干擾素對NDV復制的影響中發現，人胰腺癌細胞(human pancreatic carcinoma cells, HPACs)在接受IFN預處理后，細胞NDV病毒復制減少、細胞毒性下降，該實驗間接證明了干擾素對NDV復制的抑制作用。NDV主要通過細胞凋亡和自噬發揮抗腫瘤作用，還可刺激機體產生固有性和適應性免疫應答來殺滅腫瘤細胞。

誘導腫瘤細胞凋亡是NDV殺傷腫瘤細胞的主要機制。腫瘤細胞凋亡使自身產生免疫原性，引起趨化因子CXCL1、CCL2和CXCL10釋放，第一主要固有免疫應答者中性粒細胞在趨化因子作用下向炎癥區域遷移，產生無菌性免疫應答[16-17]。Elanku-maran 等[18]的研究表明，NDV主要通過內源性信號途徑啟動細胞凋亡，也有部分是通過外源性信號途徑啟動凋亡。內源性腫瘤細胞凋亡由腫瘤細胞線粒體膜電位擾動引發通透性改變，釋放細胞色素-c和其他膜間隙蛋白，激活下游caspase-9，產生凋亡小體后激活下游caspase-3，引起腫瘤細胞凋亡[19]。外源性凋亡途徑可由凋亡配體物質激發，激活蛋白水解酶caspase-8，進而激活caspase-3、6、7、誘導級聯凋亡反應[20]。NDV還在凋亡誘導配體(tumor nec-rosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)的殺瘤活性中起重要作用，其原理是NDV能中和腫瘤壞死因子-γ(tumor necrosis factor-γ, TNF-γ)的抗體，解除了TRAIL表達的抑制，TRAIL 在激活NK 細胞介導的腫瘤殺傷效應分子中發揮了重要的作用，增強了NK 細胞的腫瘤殺傷活性[21]。

NDV的P和NP蛋白通過內質網應激反應激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)途徑來誘導腫瘤細胞自噬，細胞自噬是細胞對外界刺激如病毒感染的一種保護性應激反應[22]。內質網是多功能的細胞器，承擔功能主要有蛋白翻譯后修飾以及盤區折疊成蛋白質。然而，細胞內鈣穩態失調時可引起內質網功能障礙，誘發內質網應激[23]。自噬在固有性和適應性細胞免疫應答中發揮了關鍵性作用，自噬細胞能夠釋放損傷相關模式分子(damage associated molecular patterns，DAMP)，增強腫瘤細胞的免疫原性，并且促進樹突狀細胞(dend-ritic cells, DCs)將抗原交叉提呈給初始T細胞[24]。不斷有證據表明病毒溶瘤和細胞自噬的相互作用能增強抗腫瘤免疫應答，刺激IFN-α、IFN-β、TNF-γ和白介素-1(interleukin-1, IL-1)等細胞因子的產生，在溶瘤病毒介導的癌細胞死亡中起重要的作用[25]。

2　NDV體內抗腫瘤作用

近年來利用NDV抗腫瘤的動物實驗也有了實質性的進展。由于天然NDV治療癌癥效果有限，反向遺傳技術一直是探索提高NDV溶瘤效果的途徑。研究人員在基因水平進行NDV基因重組，病毒拯救成功后，對小鼠腫瘤模型進行動靜脈、皮下或瘤內注射，觀察瘤體變化情況。Schwaiger[26]建立了6-8周齡雄性C57BL/6 N小鼠DT6606PDA細胞系胰腺腫瘤模型，體內研究結果顯示在NDV R75全身感染后，受NDV激活的免疫細胞啟動適應性抗腫瘤免疫應答，腫瘤生長得到抑制且不再復發。重組NDV的抑瘤作用會伴隨劇烈的炎癥反應，自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)、巨噬細胞等增多，更易引起腫瘤細胞的凋亡[27]。除了炎性細胞外，腫瘤浸潤免疫T細胞在溶瘤過程中也發揮重要作用，其能特異性識別腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen, TAA)，該研究者將TAA基因重組到NDV病毒上，拯救成功后進行瘤內注射，瘤體明顯縮小，且出現強的適應性抗腫瘤免疫應答，在這一過程中，白介素-2(Interleukin-2, IL-2)能介導T細胞的活化，間接發揮抗腫瘤作用[28]。NDV病毒除了直接注射治療外，也可以用作基因載體進行基因治療，cd作為自殺基因的典型代表能夠在載體的協助下導入癌細胞中，催化無毒的前體藥物5-氟胞嘧啶 (5-Fluorocytosine,5-FC)為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)，發揮抗腫瘤作用。Lu等[29]使用NDV病毒株作為載體，通過基因重組方法成功構建新型重組NDV rClone30-CD，并與5-FC聯用，建立起小鼠腫瘤抑制實驗模型，實驗證明重組NDV rClone30-CD/5-FC溶瘤系統具有很強抗腫瘤特性。未來的抗腫瘤治療將是在傳統放射、化療、手術療法的基礎上，結合基因及病毒治療高特異性和敏感性優點，聯合進行腫瘤治療。Meng等[30]對重組NDV D90的研究結果顯示，抗順鉑藥物的非小細胞型肺癌細胞系A549在荷瘤裸鼠模型中被其誘導后凋亡，這提示重組NDV D90病毒株可以彌補化療藥物對某些腫瘤細胞敏感性不足的缺陷，增強其抗腫瘤作用。

3　應用NDV進行惡性腫瘤的臨床治療

目前研究發現NDV重組病毒對于晚期癌癥患者有一定的療效。Csatary等[31]早期使用減毒溶瘤疫苗菌株MTH-68/H進行了一項抗腫瘤Ⅱ期臨床試驗，結果顯示癌癥相關癥狀減少，高劑量組生存率比低劑量組高。由于NDV的潛在致病能力和倫理學要求，研究者們致力于提高NDV治療的安全性，Schulze T用NDV修飾的自體腫瘤疫苗(New castle disease virus-modified autologous tumor vaccine, ATV-NDV)對癌癥術后患者采取主動特異性免疫治療(Active Specific Immunotherapy, ASI)，這項III期臨床試驗研究隨訪了50例惡性結直腸癌患者，經9-10年的隨訪觀察，結果顯示接種ATV-NDV的ASI療法能延長患者的總體生存率和無轉移生存率[32]。此外， Schirrmacher等[33]研究NDV腫瘤疫苗對免疫功能的影響中，將雙特異性抗CD28融合蛋白基因(bsHN-CD28)連接到ATV-NDV病毒載體，構建重組腫瘤疫苗后對14位結直腸癌晚期患者進行治療，結果顯示病毒修飾的自體腫瘤疫苗對肝轉移切除術后結腸癌患者有效，腫瘤特異性T細胞免疫應答得到增強。然而臨床試驗證明，即使給患者多次施加大劑量的NDV，轉移癌也很難完全緩解，且容易復發，這可能是由于NDV動靜脈轉移到腫瘤間隙的量不夠均一，或瘤內NDV擴散不良，不能達到有效的治療濃度，并且由于先天免疫、補體和細胞外基質的阻礙，引起治療效果偏差，長期大量使用還可能引起腫瘤耐藥性增加[34]。因此，克服這些障礙對于增強NDV的溶瘤療效有重要意義。Shobana[35]通過合成雄激素類似物R1881增強前列腺癌CaP細胞的融合特性，誘導胞內生成特異性前列腺抗原(prostate specific antigen, PSA)，針對該抗原在F蛋白上的切割位點設計出具有klql基序的rNDV，該重組病毒的前體蛋白F0僅能被PSA裂解激活，從而增強了NDV病毒在CaP細胞內復制的穩定性和靶向性。

4　展望

NDV具有溶瘤及誘發機體免疫應答的作用，可用于治療傳統方法無效的惡性腫瘤，且安全性好、無嚴重不良反應。重組NDV腫瘤疫苗的臨床試驗研究為惡性腫瘤的治療提供了新的思路。隨著對NDV溶瘤作用研究的不斷深入及惡性腫瘤靶向治療技術的不斷成熟，其溶瘤效應將得到進一步增強，不良反應也會減少，這將使其作為更加高效、安全的溶瘤因子，在臨床腫瘤治療方面的應用將更具前景。

利益沖突:無

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