848例結核標本DNA微陣列法檢測探討

李開吾

（鹽城市第二人民醫院 江蘇 鹽城 224002）

世界范圍內隨著各種因素，特別是環境因素的不斷改變，全世界的結核預防及控制工作顯得非常緊迫，在新技術、新方法不斷推陳出新的情況下：出現了LAMP、XPERT、以及PCR等系列的方法學，DNA微陣列基因芯片法，在臨床試驗中的應用，得以在我科開展，現就我市的開展情況作如下的探討。

1.材料

（1）所有試劑均為博奧公司提供的成品，同時提供了全套設備包括：擴增儀，雜交恒溫儀，洗滌干燥儀，恒溫振蕩儀，金屬浴，快速提取儀，微量離心機。（2）自備的有4.0%NaOH、N-乙酰-L-半胱氨酸，蒸餾水，生理鹽水，移液器，吸頭，8連排管等。（3）病源標本為我院接收的全市7縣區的痰檢樣本及羅氏培養菌株，計848例，其中痰樣本769例，菌株79例，年齡段在21至86歲之間，男性596例，女性252例。

2.方法

博奧公司提供的結核分枝桿菌DNA微陣列法的操作流程：

（1）標本準備：按照操作規程要求，按留取的痰檢后標本，LAMP檢測的標本，XPERT檢測的標本，以及羅氏培養后的菌株標本，鏡檢結果在：2～5條/300HP、1+、2+到4+不等[1]。

（2）液化處理：采用0.5%N-乙酰-L-半胱氨酸的4%NaOH加等量處理液化、振蕩及36℃恒溫箱中放置不同時間，觀察液化狀況，以及后續加0.5%酚酞指示劑和4%HCL處理等過程。觀察到吸取不粘稠，吸出不成絲，吹出呈點滴狀備用[1]。

（3）提取核酸標本：液化好的標本吸取1ml放入離心管中，12000rpm/分，離心6分鐘，棄去上清液，再加入1ml生理鹽水洗滌振蕩至底物漂浮上來后，離心12000rpm/分，6分鐘，取出，吸取上清液棄去，盡量吸干凈，加入50ul的核酸提取液，菌株直接挑取一個菌落于提取管中，用移液器直接混勻吸入后移至提取管中，蓋好后振蕩10分鐘，放入金屬浴5分鐘裂解，取出離心10000rpm/分，1分鐘備用[3]。

（4）擴增：準備所需檢標本數的3排8連排管，室溫或36℃ 溫箱中融化酶試劑PCR1.2.3，每管加酶試劑18ul，再加提取液4ul，加蓋后離心瞬間10000rpm/分，打開擴增儀，設置程序，擴增2小時44分，后在擴增儀中95℃變性10分鐘，取出放入冰水混合物中5分鐘備用。

（5）雜交：準備雜交盒及微陣列芯片及8連排管2排，將雜交混合液取出放入室溫回復至復融狀態，每管加樣9ul，按順序加入擴增DNA模板1+2；1+3液各4ul于相應的8連排管中，混勻備用，點樣，吸取12.5uL分別為rpo B和KatG及inhA DNA模板液于芯片小孔內，然后輕輕振蕩后，加蓋閉合后放入恒溫雜交儀中雜交2小時取出[4]。

（6）洗滌：取出雜交盒，打開取出芯片置于片架上，放入準備好的洗滌儀中清洗，待清洗完后，取出放入干燥儀中干燥5分鐘取出備檢。

（7）判讀結果：打開熒光判讀儀及電腦進入程序，并輸入數據及信息，插入芯片，開始檢測，判讀熒光數值及結果判讀，確定其類型。

3.結果分析

2017年8月26日—2018年5月31日間共檢測848例我市7縣區的結核臨床、門診標本。①野生型：451例，占53.18%；②雙特變型人數為61例，為7.19%，單突變數59例，其中rpoB型31例占3.66%，KatG 或inhA為28例，占3，30%；③TB.DNA＜1000數為125例，占14.74%；④分枝桿菌數54例，占6.37%；⑤樣本異常數（條帶不正常）79例，占9.32%；⑥復檢數19例，占2.24%；⑦復檢成功8例，占42.11%；總突變數120例，占14.15%。上述的分布情況即為結核3種基因型微陣列法的檢測情況。

4.討論

通過結核分枝桿菌DNA微陣列法檢測全市此期間的848例標本，初步得出此時間段的我市結核病人的分布情況以及耐藥基因的出現率；同時提供給臨床及時實驗數據，指導臨床進行合理的用藥及治療，減少對病人用藥的盲目性，更具臨床針對性，為我市的近期結核預防提供有用的流行病學資料。