分子技術在食品微生物檢測中的應用

□ 鄭 波 山東省安丘市疾病預防控制中心

目前，國家食品安全標準中微生物檢測方法（GB 4789—2016）屬于傳統的食品微生物檢測方法。該方法所需設備簡單、技術成熟、準確性較高，但缺點也十分明顯，過程復雜、耗時、耗力、耗材、無法對微生物進行快速檢測。近年來，新興起的分子技術站在RNA、DNA水平上將一些微生物檢測出來，其在食品微生物檢驗方面的優勢日漸凸顯，已成為一種重要的食品微生物檢測方法。

1 基因探針技術

核酸原位雜交和膜上印跡雜交是在食品微生物檢測中最常用的2種基因探針技術，其具有定位性強、檢測速度快、操作簡易、特異性好及靈敏度高等諸多特點。目前，食品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌等大多數微生物都可以通過特異性的基因探針檢測出來。

2 PCR技術

PCR技術即聚合酶鏈反應，出現于20世紀80年代，是一種能短時間內體外快速擴增的核酸擴增技術。因其具有產率高、特異性強、靈敏度高、重復性好及易自動化等特點，在食品微生物檢測方面應用越來越廣泛。

2.1 常規PCR

早在20年前，科研人員就采用傳統的PCR檢測技術實現了對沙門氏菌的檢測[1]。目前，PCR技術能實現大多數食品微生物檢出率在99%以上。

2.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR，是指通過對PCR反應體系中加入的熒光信號積累實時監測，再通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。因其具有操作簡便、準確率高、可實時定量、特異性強、靈敏度高、交叉污染少及自動化程度高等諸多優點，近年來在食品微生物檢測中應用越來越多。

2.3 多重PCR

多重PCR具有同時對多個微生物基因進行檢測的特點，在食品中多種微生物的同時檢測應用十分廣泛。如金黃色葡萄球菌具有較多毒力基因，可采用多重PCR方法對金黃色葡萄球菌中多個毒力相關基因進行同時檢測，可以檢出微生物，了解微生物含毒力相關基因的致病性的強弱和數量多少。

2.4 免疫PCR

免疫PCR，是在20世紀90年代初研發出來的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術手段，可以將抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性進行有機融合，利用一段已知DNA分子對抗體進行標記作為探針，在抗原抗體復合物上PCR對這段DNA分子進行擴增粘附、電泳定性，按照相關的特異性PCR產物的有無，來對待測抗原是否存在進行判斷。

2.5 反轉錄PCR

逆轉錄聚合酶鏈反應，即RT-PCR檢測技術，其工作原理是提取細胞中的RNA，將其作為模板獲取cDNA，之后有效擴增PCR。反轉錄PCR方法不僅可以應用于食品微生物RNA檢測，也用來檢測在生長或侵染過程中食品微生物特定基因的表達變化量。

3 基因芯片技術

基因芯片的概念來源于計算機芯片，通過將大量按檢測要求設計好的探針固化，能一次雜交、檢測出多種靶基因的微生物，具有高精確度、高精密度和高靈敏度分析、多參數同步分析、快速全自動分析等特點，這對于建立靈敏高效的食品檢測體系有著傳統方法無可替代的優勢，成為目前鑒別食品微生物的最有效的手段之一。目前，我國已將此技術引入國家食品標準中，如《出口食品中致瀉大腸埃希氏菌檢測方法 基因芯片法》（SN/T 3152—2012）等。

4 免疫分析法

4.1 酶聯免疫分析法

目前，ELISA試劑盒是最成熟的技術，微生物檢測一般采用夾心模式，在獲得微生物特異性抗原抗體之后，就能開發出靈敏度高和特異性強的快速檢測ELSIA試劑盒。目前，進口產品主要有美國Transia系列、荷蘭Biocheck酶聯免疫ELISA試劑盒等，國產則是良潤生物公司等生產的ELISA檢測試劑盒，檢測品種主要包括食品中的志賀氏菌、沙門氏菌、單增李斯特、金黃色葡萄球菌等微生物。

4.2 膠體金檢測卡

該技術工作原理是以層析膜作為反應載體，以膠體金作為顯色信號，將所需試劑都集成到檢測卡或檢測紙條上，加入待測樣品后20 min內就能肉眼觀察檢測結果，因此非常適合現場快速檢測。目前，進口產品主要是美國SDIXRapid Check系列，國產則是良潤生物公司生產的膠體金測試卡，檢測品種主要包括食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等微生物。

5 其他分子技術

隨著科學技術的發展，很的分子技術不斷被應用于食品微生物檢測領域，如核糖體間隔區分析技術、核糖體RNA基因分析技術、基因重組法、生物傳感器技術、DNA指紋圖譜技術和功能性基因差異的DNA圖譜技術等。

傳統的微生物檢測方法已逐漸難以滿足現代社會對食品微生物快速精確檢測的需求，分子技術憑借操作簡便、靈敏高效、特異性強等優點正逐漸成為微生物分類鑒定的主要手段，可使微生物的檢測逐步向靈敏度高、特異性強、重復性大、簡易經濟的方向不斷發展。目前應用于食品微生物鑒定方面的分子技術還相對有限，大多還處在實驗室階段，大部分僅能作為標準檢測方法的參考。