交叉引物等溫擴增-核酸試紙條技術檢測蠟樣芽孢桿菌

□ 劉 敏 萊蕪檢驗檢疫局

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是比較常見的引發食源性疾病的病原菌[1]。目前，用于蠟樣芽抱桿菌的檢測方法有常規平板培養篩選法、PCR、酶反應法、免疫學技術等。近年發展起來的交叉引物等溫擴增技術（Cross Priming Amplification，CPA）對儀器設備的要求低[2]。本文擬結合交叉引物等溫擴增技術和核酸試紙條技術，建立一種高靈敏、高通量、特異性好、操作簡捷的蠟樣芽胞桿菌快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與試劑

蠟樣芽孢桿菌（ATCC7064）、沙門氏菌（ATCC14028）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）和志賀氏菌（ATCC12022）均為萊蕪檢驗檢疫局技術中心凍存菌株。甜菜堿、MgS04購自Sigma公司，DNA Ladder Marker、BstDNA聚 合 酶、dNTPs、10×PCR Buffer、10×loading Buffer、rTaq DNA 和DNA快速提取試劑盒購自TaKaRa公司，核酸檢測試劑條和檢測裝置購自杭州優思達生物技術有限公司。試驗中所涉及的微生物培養基均購自北京陸橋公司。

1.1.2 CPA引物與探針的設計

CPA引物及探針序列如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株DNA模板的制備

分別接種蠟樣芽孢桿菌菌株及非蠟樣芽孢桿菌菌株于營養瓊脂平板上，培養18～24h后抽提單菌落細菌DNA，-20℃保存待用。

表1 CPA引物及探針序列

1.2.2 目的基因重組克隆質粒的構建

以蠟樣芽孢桿菌基因組為模板，用外圍引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。該PCR反應體系為 BCOF 0.8μmol/L 、BCOR 0.8 μmol/L、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs 2.0 μL 以 及 rTaq 0.3 μL，加水補足至25.0 μL。反應條件：94℃ 5min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃30s，30個循環；72℃5min。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物是否與目的片段大小一致。切膠回收轉化至感受態細胞，提取重組克隆質粒進行測序分析，驗證產物是否為蠟樣芽孢桿菌核酸反應的特異性目標片段。

1.2.3 CPA反應體系的建立與優化

以蠟樣芽孢桿菌基因組為模板，用1對外圍引物、1對交叉引物及2條標記后的探針，按照通用的CPA擴增條件組成20 μl的反應體系。在63℃恒溫條件下反應60min，凝膠電泳對擴增產物進行檢測，驗證用于CPA擴增的引物及探針是否可行[3]。

1.2.4 CPA結合核酸試紙條法判定檢測結果

取擴增產物，采用核酸試紙條進行結果判定。當檢測線和質控線同時出現紅色條帶，則判為陽性，表明樣本中含有被檢測的目標核酸產物。若檢測線沒有條帶出現，而只有質控線出現紅色條帶，則判為陰性，表明未檢測出目的核酸產物[4]。

2 結果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌gyrB基因片段陽性克隆質粒的構建與驗證

電泳結果表明，該擴增片段與目的序列一致，其大小約為330bp，測序結果也表明該PCR擴增產物即為蠟樣芽孢桿菌gyrB基因的特異性序列。

2.2 CPA擴增反應體系的優化結果

圖1 CPA擴增反應體系的優化

結果如圖1所示，A中當Mg2+濃度為3.0～4.5mmol/L時，均出現電泳條帶；但當Mg2+濃度為4.0mmol/L時，條帶最亮，即為最佳Mg2+使用濃度。B中，dNTPs濃度在0.2～0.6mmol/L范圍內均能發生有效擴增，但當濃度為0.5mmol/L時，電泳條帶最亮，即為最佳dNTPs濃度。C中，在甜菜堿濃度為0.6～1.2mol/L時均有較清晰的電泳條帶出現，且亮度隨著甜菜堿濃度增大而增大，當1.0mol/L時條帶最亮，即甜菜堿的最佳濃度。D中，當Bst DNA polymerase濃度為8U和10U時電泳條帶最亮，且目測二者亮度基本相當，為節約試驗成本，選取8.0U為最佳的Bst DNA polymerase使用濃度。E中，當溫度為60℃時，出現較為明顯的電泳條帶，最亮條帶出現在62℃，高于此溫度后，擴增條帶開始變暗，則最佳反應溫度為62℃。F中，當反應時間為30min時CPA反應無法發生，45min時有輕微的擴增條帶出現但較暗，最亮電泳條帶出現在60～75min，反應時間超過75min后條帶逐漸變暗，則最佳反應時間為60min。

3 討論

本研究針對蠟樣芽胞桿菌特異性基因gyrB保守區域設計引物進行交叉引物恒溫擴增，建立了可用于快速篩選蠟樣芽胞桿菌的CPA-核酸試紙條法。在該反應體系的建立過程中，通過分析比較反應體系中多個因素的優化結果，發現Mg2+、dNTPs、甜菜堿、Bst DNA polymerase濃度以及反應溫度、反應時間均能影響檢測效果。但該方法的檢測靈敏度有待進一步研究。