蛋白質組學在肉類研究中的應用研究進展

侯 然，盧士玲，王慶玲，姬 華，李文慧，董 娟*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

近年來，肉類消費的高速增長推動肉類生產規模持續擴大、產業結構升級和產品的多樣化，這些均對肉類產品的生產加工、品質等方面提出了更高的要求。肉與肉制品品質一直都是消費者關心的重要問題。肉類品質的變化主要體現在肉的嫩度、色澤、風味、保水性及營養價值等方面[1-3]，肉類品質變化的作用機制仍需深入研究。1986年，已經有學者提出以基因組為單位，研究基因組的結構、功能及表達產物的基因組學[4]。隨著基因組學的發展，許多學者應用基因組學對影響肉類品質的基因進行研究，為肉類研究提供了新的方法[5]?；蚪M學旨在解析生命的全套遺傳信息，系統研究這些遺傳信息代表的生物學功能引起了科學家們的興趣，由此產生了蛋白質組學[6]。2001年，蛋白質組學成為僅次于干細胞研究的六大熱點之一[7]。經過多年發展，以蛋白質為基礎的蛋白質組學在諸多領域被應用，其中差異蛋白質組學發展特別迅速。如今，蛋白質組學已經成為肉類研究的策略之一，并且已經被證明是研究肉類及其制品蛋白質變化的有力工具[8]。

1 蛋白質組學技術

蛋白質組學作為后基因組時代的熱門工具之一，其基本研究策略是先對蛋白或酶解肽段進行預分離富集，再通過質譜（mass spectrometry，MS）技術對關鍵蛋白或肽段進行分析鑒定。蛋白質組學的主要優點是在1 次分析中可以分離和定量數百種蛋白質，同時能進行單個蛋白質的詳細表征、鑒定切割位點和蛋白質修飾，如蛋白質氧化和磷酸化[8]。蛋白質組學技術發展至今，其分離與鑒定技術不斷被改進、創新，使蛋白質組學技術更高效、準確。

1.1 蛋白質的分離與鑒定

蛋白質的純度會嚴重影響蛋白質的鑒定結果，因此蛋白質的高效分離成為蛋白質組學技術的重要基礎。通常采用的預分離技術包括基于凝膠的方法（二維凝膠電泳（two dimensional gel electrophoresis，2-DE））和無凝膠方法（如毛細管電泳和多維色譜技術）[9-10]。若要使分離鑒定體系更簡單，通常在樣品預處理時引入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、等電聚焦或細胞器分離等手段[11]。蛋白質組學中最常引入的預分離技術為SDS-PAGE，但近年來，一種新型的等點聚焦預分離系統，即OFFGEL系統出現在蛋白質組學分析中。雖然OFFGEL系統存在分離時間長、所需樣本量大等缺點，但其對肽段的分離具有高分辨率、高樣品加載及靈活性等優點，可以作為現代蛋白質組學分析的可靠工具之一[12-13]。OFFGEL系統在醫學領域中得到廣泛應用，在肉類研究中應用較少，因此該技術在肉類研究中具有很大前景。MS技術通常用于對所得蛋白質的鑒定，為使鑒定結果更加準確，通常將多種鑒定技術結合使用。液相色譜-二級質譜聯用（liquid chromatography-MS/MS，LC-MS/MS）技術以及基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-MS，MALDI-TOF-MS）在蛋白質分析鑒定中已被廣泛應用。另外，以MS為基礎的選擇性反應監測/多反應監測（selected reaction monitoring/multiple reaction monitoring，SRM/MRM）技術已對肉類成熟和加工過程中發生的大量生化過程和蛋白質變化進行了部分闡明[14]。

1.2 蛋白質的定量

穩定同位素標記和非標記定量技術2 種定量方法已被應用于肉類研究[15-17]。其中，穩定同位素標記技術需要特定的軟件、數據分析的專業知識以及昂貴的標記同位素，且對多種蛋白質的鑒定往往缺乏合適的標簽[18-19]。同位素相對標記與絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術是穩定同位素標記技術的一種，因其可用于鑒定和定量多個（最多8 個）不同蛋白質樣品的豐度變化[20-22]而在近年來被廣泛使用。Bjarnadóttir等[23]在牛肉嫩度研究中發現，采用iTRAQ和2-DE技術鑒定的蛋白質表現出類似的變化，這表明iTRAQ作為新的蛋白質定量技術在肉類品質變化研究中具有很大潛力。與穩定同位素標記技術相比，非標記定量技術對質譜儀和數據分析的要求較高，但其操作簡單、成本較低，數據分析軟件的不斷發展也大大促進了該技術的應用。

2 蛋白質組學在肉類快速檢測中的應用

隨著生活水平的提高，消費者在肉類選擇上更加傾向于高品質、安全的肉及肉制品。由于屠宰加工時肉的數量較多，對肉類品質的鑒定成為了難題。蛋白質組學作為一種先進的研究方法，通過對特定蛋白質（即生物標記物）的檢測為肉類品質快速檢測探索了一條方便、快捷的有效途徑。

2.1 蛋白質組學在肉類品質鑒定中的應用

蛋白質組學旨在結合電泳和蛋白質測序技術闡明蛋白質的生物學功能，可用于鑒定預測肉類感官品質的分子標記物或生物標記物[24]。這些生物標記物是生物過程的量化指標，可能有助于增加對肉類品質變化的生化過程的理解[25]。滴水損失與嫩度可以作為判定肉類品質的標準。Pas等[26]運用蛋白質組學方法鑒定豬背最長肌的差異蛋白，結果表明，異檸檬酸脫氫酶、HSP27蛋白、肌球蛋白及超氧化物歧化酶可以作為滴水損失的生物標記物，其最大準確度稍高于80%，且蛋白質組合生物標記物明顯比單一的蛋白質標記物具有更高的準確性。Wu Wei等[27]對貯藏期間中國魯西黃牛2 種肌肉的肌漿蛋白質組進行分析，發現幾種蛋白質與肉色屬性密切相關，同時蛋白質的差異具有肌肉特異性，且在貯藏期間負責肉色穩定性，其中，甘油-3-磷酸脫氫酶、果糖-二磷酸醛縮酶A型異構體、糖原磷酸化酶、過氧化物酶-2、磷酸葡萄糖苷酶-1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]及熱休克同源蛋白（71 kDa）可以作為肉色的生物標記物，用來預測貯藏期間肌肉的顏色穩定性。Wiel等[28]確定出肌酸磷酸激酶M型、結蛋白和轉錄激活因子3 種蛋白質可以作為保水性的生物標記物，其中結蛋白也是與滴水損失有關的差異蛋白，結蛋白降解速率可能與肌原纖維收縮的持續時間和程度有關，因此結蛋白有可能同時作為滴水損失的生物標記物。如今，蛋白質組學技術對蛋白質功能研究的不斷深入為明確1 種或1 組鑒定肉類品質的特定生物標記物提供了理論基礎。通過對特定生物標記物的定量進行肉類品質鑒定將為人們對肉類的選擇提供極大的方便。

2.2 蛋白質組學在肉類摻假鑒定中的應用

目前，肉類摻假的手段主要有以次充好及以假亂真。我國已有新聞報道，在肉制品銷售中出現將廉價肉摻入高價肉中或將同種類的低質量肉（PSE（pale，soft and exudative）肉或DFD（dark，firm and dry）肉）摻入高質量肉中進行售賣，以獲得高價利潤的行為。雖然這些摻假行為被嚴厲打擊，但仍有商家知法犯法，因此對于肉類摻假的快速檢測必不可少。蛋白質組學方法是在酶聯免疫法、聚合酶鏈式反應技術、近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIR）技術及色譜技術后出現的一種新的肉類摻假檢測方法。Naveena等[29]利用OFFGEL系統結合MS技術對牛肉、水牛肉和羊肉的熟肉混合物進行鑒定，并與基于DNA的肉類物種鑒定方法進行比較，結果表明，新型蛋白質組學技術可以檢測出低于0.5%的混合肉，基于DNA的檢測方法可以檢測出低于0.5%的生肉混合物和1.0%的熟肉混合物，表明蛋白質組學技術可以應用于肉制品中物種的檢測，同時可以結合以DNA為基礎的檢測技術，探索出更快、更準確的肉類檢測方法。Montowska等[30]對法蘭克香腸進行組學分析，發現不同物種的蛋白質組具有差異，通過差異分析準確鑒定出雞、豬和牛3 個物種，認為可以通過蛋白質組學方法對食物中特定的肽標記物進行定量及鑒定，以檢驗產品是否摻假。不同物種可以利用蛋白質組學技術進行檢測，同樣劣質肉與正常肉也存在差異。Desai[31]、Franco[32]等分別對PSE肉與正常肉、DFD肉與正常肉進行蛋白質組學分析，發現代謝酶類的表達使正常肉與劣質肉產生明顯差異。許多研究證明不同物種、不同質量的肉類及肉制品的蛋白表達具有差異，因此運用蛋白質組學原理確定肉的特定蛋白，以此區分肉的組成是可行的。

2.3 蛋白質組學與多種組學相結合在生物標記物作用機制研究中的應用

在肉類的分析檢測中，除了單獨進行蛋白質組學分析外，還可以將蛋白質組學與多種組學技術結合進行高效研究[33]。Yang Hu等[34]采用綜合分析方法對沙仔嶺和約克夏豬的背最長肌進行蛋白質組學和轉錄組學分析，通過蛋白質組學鑒定得到23 種差異表達蛋白質，這些蛋白質可能參與了脂肪酸代謝、糖酵解途徑和骨骼肌生長，并且明確了4 種基因編碼蛋白（ENO1、ENO3、ATP5B和TPI1）參與糖酵解和脂肪沉積，同時又利用轉錄組學對ATP5B蛋白進行了克隆表達，結果表明，ATP5B蛋白可能在豬骨骼肌發育中起關鍵作用，更加深入地闡明了相關分子機制。Fran?ois等[35]采用蛋白質組學與基因組學結合的方法對鴨肝臟蛋白質組數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）進行分析，證實了多個多效QTL與糖酵解和脂肪生成的代謝途徑有關，并最終導致脂肪肝的形成，并且表示需要通過轉錄組學和代謝組學方法做進一步研究，以確定影響這些表型性狀的生物標記物。轉錄組學和代謝組學可以作為蛋白質組學的補充研究，蛋白質組學、代謝組學和轉錄組學3 種研究方法相輔相成，共同構成了一個完整的生物機制研究系統，有利于今后的肉類品質研究。

3 蛋白質組學在肉類品質指標分析中的應用

3.1 肌內脂肪沉積

牛肉是人們比較喜愛的肉類之一，評價牛肉質量的方法之一就是評價其大理石花紋。大理石花紋是由肌內脂肪形成的，因此肌內脂肪（intermuscal fat，IMF）沉積成為影響牛肉食用品質的關鍵因素[36-37]。Romao等[38]的研究表明，蛋白質表達上調與下調的動態平衡共同調節脂肪組織的復雜生物學功能。Mao等[39]對不同脂肪含量的牛肉進行蛋白質組學分析，結果表明，HSPB1蛋白（一種熱休克蛋白）的表達具有差異，這可能是由于HSPB1蛋白的低表達導致胰島素抵抗，而胰島素促進脂質的合成并抑制其降解，從而導致脂肪沉積，并且高水平的胰島素也刺激MAPK途徑[40]，導致更多的脂肪沉積。Poleti等[41]整合轉錄組輔助無標記定量蛋白質組學方法，研究背最長肌中的IMF沉積途徑，結果表明，高IMF沉積組中存在的4 種糖酵解酶豐度較低，且肌動蛋白結合蛋白（ACTN1、ARPC2、SSH1及TTN）的表達明顯下調，參與細胞脂質代謝過程的FAM135A蛋白和與細胞內信號、細胞骨架結構有關的PLEKHA5蛋白的表達上調，表明糖酵解代謝、肌動蛋白細胞骨架信號傳導、細胞黏附連接、MAPK和胰島素途徑是影響IMF沉積的重要生物學機制。烯醇酶3作為糖酵解關鍵酶，其許多亞型已被證實對于豬的IMF沉積具有影響[42-43]。通過蛋白質組學技術對不同脂肪沉積的肌肉進行分析發現，大多影響IMF沉積的蛋白質均會直接或間接調節重要的生物途徑，通過對差異蛋白的作用機理進行研究，可以為改善肉質提供基礎，并為確定脂肪沉積的生物標記物提供依據。

3.2 嫩度

嫩度是肉類品質評價的另一重要指標，蛋白質組學的出現使得人們可以通過整體評估肌肉蛋白質或其組成更加深入地了解影響肉類嫩度的生物化學機制。Kiran等[44]對水牛的2 種肌肉進行分析，結果表明，2 種肌肉的嫩度具有差異；隨后對2 種肌肉進行蛋白質組學分析，鑒定到3 種蛋白質（鈣轉運ATP酶2C型、鈣/鈣調蛋白依賴性3’,5’-環核苷酸磷酸二酯酶1B和熱休克蛋白β-1）的差異表達，表明這3 種蛋白質與肉的嫩度具有一定相關性。其中熱休克蛋白是一個非常特別的蛋白質，是導致肉類嫩度差異的關鍵蛋白質，其作用機理可能是熱休克蛋白表達下調加速了肌動蛋白解體或降解，從而改善了肉的嫩度[45-46]。許多研究均證明熱休克蛋白可以作為肉類嫩度的生物標記物，其他可作為生物標記物的蛋白質多為糖酵解酶和參與結構形成的蛋白質，如肌鈣蛋白[47]。Beldarrain等[48]利用OFFGEL結合MS技術對不同嫩度的肉進行分析，發現7 種蛋白質（肌鈣蛋白T、熱休克蛋白β-1、肌酸激酶、肌動蛋白、肌鈣蛋白C、肌球蛋白1/2）存在表達差異，肌球蛋白1作為肉質嫩度的標志物未被報道過，其他差異蛋白均有文獻曾指出可作為嫩度評價的生物標志物。此外，李婕等[49]發現，熱休克蛋白與肉的保水性和嫩化作用密切相關，但其是否可以作為鑒定全部肉類品質的標準仍需大量研究。

3.3 肉色

蛋白質組學技術的創新應用揭示了肉色變化的生物基礎，指出許多內源性和外源性因素均影響家畜和家禽的肉色，并且肉色具有物種特異性和肌肉特異性[50]。肌紅蛋白是負責肉類紅色的主要色素，其變化取決于肌紅蛋白及其3 種氧化還原形式（脫氧肌紅蛋白（deoxymyoglobin，DeoMb）、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb））的濃度，肌紅蛋白的化學性質及其與其他生物分子的相互作用影響宰后骨骼肌的顏色穩定性[51]。Wu Wei等[52]結合蛋白質組學技術對魯西黃牛貯藏期間的肉色變化進行研究，結果表明：在貯藏第0天和第5天、第10天和第15天，牛肉的表面紅度值隨著貯藏時間的增加呈現明顯的下降趨勢，并且MetMb含量急劇上升，并伴隨著OxyMb含量的下降，因此MetMb的積累可能是造成肉色呈暗褐色的原因；同時，參與糖酵解代謝和氧化還原過程的代表性蛋白質丙糖磷酸異構酶、L-乳酸脫氫酶A鏈異構體、果糖二磷酸醛縮酶A型異構體、過氧化物氧還蛋白-6和丙酮酸激酶同工酶M1/M2異構體的表達量發生明顯變化，這些蛋白質均可以通過影響生物體代謝來影響肌紅蛋白含量，表明這幾種蛋白質的表達與肉色變化有關，可以作為監測肉色變化的候選預測因子。Canto等[53]對包裝后牛肉背最長肌的肌漿蛋白質組進行研究，結果表明，在貯藏第0天和第11天時，9 種蛋白質在牛排中的表達量差異性很大，其中3 種糖酵解酶（葡萄糖磷酸變位酶-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和丙酮酸激酶M2）在變色牛排中過度豐富，與紅色和顏色穩定性呈正相關，其原因可能是顏色穩定的牛排中過多的糖酵解酶有助于肌肉中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（nicotinamide adenine dinucleotide hydrate，NADH）的再生，從而提高顏色穩定性，而顏色不穩定牛排中的肌紅蛋白原位翻譯后修飾損害了顏色穩定性，這些結果說明上述3 種蛋白質與牛肉顏色變化顯著相關。肉色是肉類加工處理過程中最重要的特征之一，而肌紅蛋白在維持肉色中起到重要作用。因此，可以利用蛋白質組學技術對影響肌紅蛋白變化的蛋白質進行研究，尋找預防肉色改變的方法。

4 結 語

通過蛋白質組學分析鑒定差異蛋白，為快速鑒定肉品質提供了準確、高效的途徑，同時蛋白質組學技術與其他組學技術的結合使用為更加深入地了解肉制品品質變化的生物化學機制提供了有效途徑。近年來，眾多研究發現熱休克蛋白是非常特殊的蛋白，其與肉的嫩度、IMF沉積、滴水損失及肉色均存在極大相關性，因此熱休克蛋白極有可能成為肉品質檢測中快速且有效的標記性蛋白。然而，蛋白質組學發展至今不到30 年，其在肉類研究中的應用并不完全，仍然具有很大的應用前景。蛋白質組學技術應用方法的不斷創新將會為科學研究的進一步發展做出更大的貢獻。