新型納米級超聲微泡的特性及其在疾病治療中的潛在作用

劉旭東 王萍 馬蘇亞

超聲微泡是臨床上常用的疾病診斷對比劑。然而，常規超聲微泡的循環時間短和粒徑大的缺點嚴重限制了其有效滲入病變組織的能力。新近研究發現粒徑在700nm內的納米級超聲微泡可以在超聲誘導膜通透性升高的基礎上快速通過血管內皮，并在靶部位聚集[1]。目前，新型納米級超聲微泡在疾病治療中的作用是研究的熱點之一。本文就新型納米級超聲微泡的特性及其在疾病治療中的潛在作用作一綜述。

1 超聲微泡

超聲除了具有方向性好、穿透能力強和聲能集中等特點外，還能依靠與生物組織間的各種效應（機械效應、熱效應和空化效應）從而介導載藥或基因的超聲微泡進行靶向治療[2]。

蘇俊波等[3]研究了超聲微泡介導堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在受損面神經修復中的可行性及有效性。他們構建了大鼠模型，然后通過股靜脈注入載bFGF的超聲微泡。結果發現，與對照組相比，超聲輻照介導攜帶bFGF超聲微泡組中bFGF mRNA和蛋白表達量顯著升高；并且大鼠面神經電生理表現及一般狀況明顯優于對照組。由此可見，超聲輻照聯合超聲微泡可明顯提高基因的轉染率，有助于面神經損傷的修復。孫佳星等[4]研究了低頻超聲聯合載順鉑超聲微泡對比劑對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響。他們在體外培養了人卵巢癌OVCAR-3細胞，并隨機分為對照組、超聲組、順鉑組、超聲聯合順鉑組和超聲聯合順鉑與超聲微泡組。結果發現，超聲聯合順鉑與超聲微泡組對細胞的增殖抑制作用及促凋亡作用顯著強于其他處理組及對照組，其抑制細胞增殖的機制與順鉑誘導腫瘤細胞發生凋亡有關。這些實驗說明，超聲微泡在超聲的介導下促進基因和藥物進入細胞內，進而發揮治療的作用。

超聲微泡作為藥物和基因遞送系統的主要缺點是它們相對較大的粒徑（1～10μm），這是限制超聲微泡遞送藥物和基因穿透血管上皮到達目標組織的主要問題。在靜脈注射超聲微泡時，超聲微泡進入并被限制在血液循環中，因此，載藥/基因超聲微泡的應用主要局限于心血管和腫瘤血管內皮的靶向中[5]，而粒徑在700nm內的納米級超聲微泡可以快速通過血管內皮，從而進入靶組織。因此，納米級超聲微泡在臨床治療方面具備更強的優勢，已成為超聲微泡研究方向的熱點之一。

2 納米級超聲微泡

2.1 特性及其與藥物或基因的連接方式 納米級超聲微泡是指以高分子聚合物、脂質體或白蛋白為外殼，分子大小在1nm～1μm之間的內含氣體超聲微泡[6]。其特性有：（1）可通過毛細血管壁和細胞膜壁來遞送藥物，從而減少機體的不良反應并增強治療的效果[7]。（2）可通過增強的滲透和滯留效應從而聚集在靶向組織內，提高靶組織內的藥物濃度[8]。（3）用配體修飾的納米級超聲微泡可以黏附到靶向組織上，從而促進藥物在細胞內的攝取。（4）作為靶向遞送載體，納米級超聲微泡可以在受到聲波作用時釋放其外殼上或內部的藥物或基因，從而減少對正常組織的損傷。

納米級超聲微泡攜帶藥物或基因的方式主要有[9]：（1）將藥物或基因與納米級超聲微泡的表面外殼或其構件連接起來。張淼[10]制備了攜載靶向雄激素受體小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）的納米級超聲微泡，利用多聚賴氨酸法將siRNA通過靜電吸附在納米級超聲微泡的表面，并在熒光顯微鏡下觀察發現：納米級超聲微泡與雄激素受體siRNA緊密結合；粒徑檢測儀測量平均粒徑為（608.2±13.3）nm，Zeta電位為（-29.9±6.5）mV。與常規超聲微泡對比劑相比，這種納米級超聲微泡體內顯影時間顯著延長（P＜0.05），腫瘤中心乏血管區域顯影效果較好，為下一步利用超聲輻照微泡破壞，釋放siRNA到腫瘤組織間隙當中，進而提高其對腫瘤細胞的治療效果提供了研究基礎。（2）將藥物或基因封裝在納米級超聲微泡氣體或液體核心中。葛建麗等[11]制備了載紫杉醇的聚乳酸-卵磷脂納米級超聲微泡，通過冷凍干燥技術以及改良的超聲復乳-溶劑揮發法，將紫杉醇包裹在納米級超聲微泡核心中。借助透射電鏡可以觀察到這種納米級超聲微泡的大小均勻，互不粘連；所有納米級超聲微泡表面光滑，外觀圓整。通過激光衍射粒度分析儀測定顯示，納米級超聲微泡粒徑為（60.5±4.6）nm，粒徑大小波動在 30～110nm。通過這種方法制得的紫杉醇納米級超聲微泡的載藥量和包封率也分別達到了19.8%和87.8%，可以更好地應用于疾病的治療。（3）將藥物或基因封裝進納米級超聲微泡后再連接到微米級超聲微泡的表面。

2.2 制作方法 納米級超聲微泡的制備過程復雜。通常先采用薄膜水化法[12]、模板法[13]、冷凍干燥法[14]、機械振蕩法[14]和乳化法[15]等方法制備得到殼核結構的納米級超聲微泡，然后通過靜電吸附法、共價結合法、生物素-親和素連接法和硫醇-馬來酰亞胺化學法[16]等連接方式在納米級超聲微泡表面連接上靶向物質。

王平等[17]制備了可穩定顯像的新型小粒徑納米級超聲微泡比對劑，并評價了其在體內外的超聲顯像效果。研究者首先通過薄膜-水化、聲振-通氣及多級分離等步驟制備了納米級脂質微泡，針對制備過程中的主要影響因素設計了正交試驗，篩選出所構納米級超聲微泡粒徑小和重復性好的實驗條件；然后通過光學顯微鏡和Zeta粒徑儀檢測了納米級超聲微泡的大小形態和粒徑分布；最后在動物體內通過超聲顯像檢測了其增強顯像的效果。結果發現，這種納米級超聲微泡呈圓形，分布均勻且無明顯聚集，粒徑范圍為238.6～340.7（276.0±24.1）nm，Zeta電位為（-14.0±0.6）mV。體外超聲檢測顯示，納米級超聲微泡在超聲造影狀態下能持續穩定顯像，進入到二維灰階狀態時，納米級超聲微泡瞬間被破壞，顯像效果消失。體內超聲顯像顯示，在造影狀態下納米級超聲微泡可明顯增強大鼠肝臟和腎臟的回聲信號。他們的實驗表明這種新型納米級超聲對比劑在超聲輻照下的良好特性，為進一步的腫瘤組織血管外靶向及腫瘤局部藥物釋放研究奠定了基礎。

Xie等[18]制備了可靶向診斷早期肝臟缺血再灌注損傷的脂質納米級超聲微泡，并在體內外定量評價了這種脂質納泡超聲造影的顯影效果、穩定性及造影參數的可靠性。研究者應用薄膜水化和超聲振蕩法制備普通的脂質納米級超聲微泡，并通過生物素-親和素連接法，將生物素化的細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）抗體靶向連接于生物素化的脂質納泡上，制備出綠色熒光標記的載ICAM-1抗體的靶向脂質納泡；然后通過透射電鏡、MAlvern納米激光粒度儀和激光共聚焦顯微鏡檢測了納米級超聲微泡的大小形態、粒徑分布及其在體外與靶細胞的結合情況；最后在動物模型內評估了這種靶向脂質納米級超聲微泡的顯影效果。結果顯示靶向脂質納米級超聲微泡粒徑約（148.15±39.75）nm，Zeta電位（-28.4±7.9）mV，濃度（3.6～7.4）×109個/ml，與抗體結合率高達95.7%；激光共聚焦顯微鏡下觀察發現脂質納米級超聲微泡的綠色熒光較好地黏附在人肝竇內皮細胞表面。動物體內超聲造影顯示，靶向脂質納米級超聲微泡峰值強度及增強持續時間明顯高于普通納米級超聲微泡，達峰時間明顯提前。他們的實驗證實了這種納米級超聲微泡的穩定性和靶向性，為將來研究靶向藥物傳遞及攜帶基因治療提供了良好的實驗基礎。

3 納米級超聲微泡的應用

由于納米級超聲微泡獨有的特性，越來越多的文獻表明其在疾病治療中具有顯著性作用，現從以下幾個方面進行論述。

3.1 在腫瘤中的應用 許多實體腫瘤的血管內皮細胞間隙約380～780nm，大于正常的血管內皮細胞間隙，增強的高通透性和滯留效應允許納米級超聲微泡通過這些腫瘤的毛細血管，并聚集在實體腫瘤組織內[19]。在此基礎上，超聲介導納米級超聲微泡作為載體進行靶向治療可進一步增加藥物和基因的遞送效率，推動了其在血管外領域的拓展，尤其在腫瘤的治療中具有較好的應用前景。

Suzuki等[20]制備了一種新型的脂質體納米級超聲微泡。為了研究這種納米級超聲微泡和超聲聯合治療癌癥的可行性，他們將Colon-26細胞接種到BALB/c小鼠腹側以皮下成瘤，并在高強度超聲輻照下在小鼠體內進行了試驗。結果發現，與對照組相比，超聲介導的脂質體納米級超聲微泡組中小鼠體內結腸癌細胞的生長受到了顯著抑制。進一步研究表明，超聲介導的納米級超聲微泡可通過空化效應激活體內的免疫系統（尤其是CD8+T細胞）從而抑制腫瘤的生長。他們的實驗結果說明了超聲介導的空載納米級超聲微泡在抑制腫瘤細胞生長中的作用。

Yin等[21]開發了由共聚物和脂質構成的納米級超聲微泡，以研究其在腫瘤靶向治療中的作用，在投射電子顯微鏡下發現這些微泡的大小為250～500nm，其在超聲輻照下可穩定存在約50min。為了研究這種納米級超聲微泡在腫瘤中的作用，Yin等[21]將靶向抗凋亡基因sirtuin-2的siRNA與納米級超聲微泡混合后，通過尾靜脈注射進神經膠質瘤裸鼠模型中。結果表明，與對照組相比，超聲輻照下載siRNA納米級超聲微泡組中神經膠質瘤細胞的生長顯著減緩；腫瘤的體積明顯小于其他組。實驗結果表明了載基因納米級超聲微泡在腫瘤的治療中具有巨大潛力。

Rapoport等[22]制備了內載有紫杉醇的全氟化碳納米乳劑，將其注射到模型小鼠體內觀察研究了這種納米乳劑在腫瘤中的作用。結果顯示與對照組相比，1MHz超聲可增強納米乳劑在腫瘤中的聚積，并可顯著誘導胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌模型中腫瘤的消退。深入研究其機制發現，在超聲作用下，納米乳劑可在局部轉化為納米級超聲微泡，從而減少了載體外殼的厚度，并通過超聲介導的空化效應增加腫瘤細胞對內載藥物的攝取。實驗結果為載藥納米級超聲微泡在腫瘤治療中的應用提供了新的思路。

3.2 在神經系統中的應用 脊髓損傷會導致患者嚴重殘疾或死亡，通常的治療選擇包括手術干預、藥物治療和干細胞移植。然而，這些方法的周期較長且效率較低，它們恢復脊髓功能的效果也并不能令人滿意。因此，尋找新的治療方法是目前的研究熱點。Song等[23]為了研究超聲介導載神經生長因子的納米級超聲微泡對于脊髓損傷的作用，構建了大鼠脊髓損傷的模型，并通過尾靜脈注射了載神經生長因子的納米級超聲微泡。結果顯示與對照組相比，通過超聲輻照的載神經生長因子納米級超聲微泡能顯著增加神經生長因子在脊髓損傷處的表達，并且減少了該位置的組織損傷，損傷處神經元的丟失與凋亡也明顯減少。研究結果證實了超聲介導納米級超聲微泡在脊髓損傷中的治療作用優于單獨使用藥物或干細胞進行治療。

甲氨喋呤（MTX）鞘內注射是目前治療中樞神經系統白血病的一種常用方法，但因其為有創操作且需重復進行，使患者常常難以接受身體和心理上的損害。改變給藥途徑是亟待解決的問題。Vykhodtseva等[24]首次發現超聲波能開放血腦屏障，開創了利用超聲技術穿顱骨治療的新領域。王翔等[25]研究了超聲聯合耦連載MTX納米級超聲微泡在促藥物跨血腦屏障轉運中的作用，他們開發了一種載MTX的納米級超聲微泡，并在大鼠體內注射了這種微泡。結果顯示與對照組相比，超聲輻照下的載MTX的納米級超聲微泡在大鼠腦組織中明顯濃聚。進一步實驗表明，血腦屏障結構的基礎腦微血管內皮細胞在超聲結合微泡輻照后依舊保持完整，可能的機制是納米級超聲微泡在超聲的作用下產生了空化作用，從而引起血腦屏障的開放。實驗結果為中樞神經系統疾病的治療提供了一種安全無創的新方法。

此外，席曉平等[26]也對新近研究進行系統分析后發現，載藥納米級超聲微泡通過空化效應可改變細胞膜的通透性、增加細胞間隙、提高藥物通過血腦屏障的效率，進而達到有效治療的目的，將成為中樞神經系統白血病一種有效的治療方案。

3.3 其他應用 Tiukinhoy等[27]用攜帶阿奇霉素的納米級超聲微泡治療感染有肺炎衣原體的人臍靜脈血管內皮細胞模型。結果表明，與對照組相比，超聲輻照納米級超聲微泡組中細菌的增生受到了顯著抑制。由此可見，超聲介導納米級超聲微泡在抗炎治療中也有明顯作用。

由于納米級超聲微泡具有粒徑小、生物可溶性好和循環時間長的特點，在診斷與治療相結合理念的指導下，Becker等[28]研究了二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）/膽固醇、DPPC/硬脂酸聚乙二醇（PEG40S）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）/PEG40S及聲諾維等材料的納米級超聲微泡在人血凝塊中的超聲增強溶栓效果。結果表明，這些新型超聲納米微泡在超聲作用下可以表現出良好的溶栓效果；同時，體外實驗發現在診斷性超聲頻率如1.4MHz的超聲波作用1h后，血凝塊重量可明顯減輕，且DSPC/PEG40S微泡組效果更明顯。該研究表明超聲介導的納米級超聲微泡也有可能實現對栓塞小動脈的再通，其中超聲輻照起關鍵作用。

4 局限性與展望

目前，納米級超聲微泡的治療作用已在細胞水平和動物模型中進行了廣泛的研究，并取得了一定的進展。超聲介導的納米級超聲微泡治療是一種非侵入性、易于接受的技術，其不僅將侵襲力最小化，還具有高度的可重復性。此外，納米級超聲微泡可以利用超聲的優點（增加血管和細胞的通透性）來促進藥物和基因的轉運，增強納米級超聲微泡在病變組織中的積聚，從而增加治療效果并減少不良反應。例如，在腫瘤的治療中，攜載藥物的納米級超聲微泡可以通過腫瘤的EPR效應更好地聚集在腫瘤組織內，提高腫瘤組織內的藥物濃度；在此基礎上，納米級超聲微泡可以連接特異性抗體來進行腫瘤的靶向治療，從而減少所載藥物對正常細胞的損害與殺傷。這樣不僅增加了藥物的使用效率，而且降低了患者的治療費用，從生理和心理上減輕了患者的負擔。

然而，仍有許多問題和困難阻礙著納米級超聲微泡在臨床中的應用，主要有以下3點：（1）需改進納米級超聲微泡的生產方法，簡化繁瑣的構建過程；（2）納米級超聲微泡的藥物和基因裝載率還應提高，并且需要更高效的特異性靶向遞送能力；（3）超聲可以增加細胞膜的滲透性，而相對較高的納米級超聲微泡濃度和較高的超聲強度可能導致周圍正常細胞和組織的損傷，因此適宜的納米級超聲微泡濃度和超聲使用參數需要被進一步探索。

隨著分子生物學、納米技術和超聲醫學等學科的不斷發展，納米級超聲微泡必將在臨床治療中擁有更加廣闊的前景。