SDF-1a模擬物CTCE-0214對重癥肺炎的治療作用及機制

劉振峰 周國旗 陳偉 陳小英 鄒麗 蔡小燕 杜作麗 楊迅 曾慶松 金成靜 吳凡 張怡然

(1遵義市紅花崗區人民醫院呼吸與危重癥醫學科，貴州 遵義 563000；2貴州中醫藥大學)

重癥肺炎(SP)是一種進展性肺部炎癥，可由局部感染快速演變為全身性感染、嚴重膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)或多器官功能障礙綜合征(MODS)等〔1〕。在所有住院的肺炎患者中，SP的治療一直是學界研究熱點。近年來在治療上雖有較大進展，但抗感染仍是治療SP的核心內容，因此清除體內感染致病菌和抑制炎癥反應對提高SP的存活率尤為重要，研發一種能夠同時增強機體殺菌能力和抑制炎癥反應的藥物是目前治療SP的熱點〔2〕。CTCE-0214 (CTCE)是一種基質細胞衍生因子(SDF)-1a的小肽類分子模擬物，SDF-1a作為趨化因子CXC家族成員之一，在體內能夠激活和募集中性粒細胞并發揮抗炎作用，然而SDF-1a在血液中的半衰期很短，這使SDF-1a在體內發揮作用有限〔3〕。CTCE在血液中較穩定并能發揮SDF-1a相似的作用。本研究采用脂多糖(LPS)誘導模型SP小鼠，通過CTCE治療后觀察小鼠肺毛細血管通透性、肺含水量、支氣管肺泡灌洗液(BAL)細胞數量和BAL中炎癥因子的表達水平，并探討CTCE對SP的保護作用機制，為SP的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑 健康、雄性、CD-1小鼠(7～8周齡)，由遵義醫科大學動物實驗中心提供，體重(18±5)g。LPS購自Sigma-Aldrich公司；小鼠白細胞介素(IL)-6、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-2和腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；聚合酶鏈反應(PCR)引物購自上海生工生物科技有限公司；Trizol 購自美國Promega公司；RNA逆轉錄試劑盒、RNA擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司；LPS、兔抗小鼠蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、Rac1和β-actin、CTCE、SDF-1a購自Sigma-Aldrich公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG購自美國Abcam公司；miR-126 inhibitors購自美國Invitrogen公司。

1.2動物模型和分組 將實驗動物隨機分為正常對照組、LPS組、LPS+CTCE組、LPS+SDF-1α組各12只。LPS組小鼠氣管內滴注LPS(5 mg/kg)，正常組小鼠氣管內滴注生理鹽水(5 mg/kg)，LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組在小鼠滴注LPS(5 mg/kg)2 h 后通過尾靜脈注射CTCE或SDF-1α(10 mg/kg)。同時在進一步實驗中將動物按照數字隨機分為LPS+CTCE組、LPS+CTCE+miR-126-NC組(陰性對照)和LPS+CTCE+ miR-126 inhibitors組。在LPS(5 mg/kg)造模24 h后處死小鼠并收集肺組織和BAL。

1.3小鼠肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量 各種小鼠在干預后從股靜脈以2 mg/kg劑量注射2%伊文藍溶液，分離肺組織，以1 ml/100 mg加入甲酰胺溶液，在酶標儀620 nm處測吸光度值，計算肺組織伊文藍的含量，以此計算小鼠肺毛細血管通透性。采用干濕重的方法測右下肺濕干重比值計算肺含水量，肺含水量=(濕重量-干重量)/(濕重量)× 100%。將BAL細胞沉淀重懸于500 μl 1×紅細胞裂解緩沖液中，在600 r/min離心5 min。將細胞小丸重懸于500 μl PBS中，用血細胞計數器計數，即為BAL細胞數量。

1.4BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α測定 采用ELISA測定BAL炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達水平，嚴格按照說明書進行，并在酶標儀中測量吸光值。

1.5qRT-PCR 在不同組中，采用Trizol試劑從肺組織中提取總RNA，通過紫外分光光度儀測定OD260/280值，取用OD260/OD280比值在1.8～2.0之間的樣本。采用RNA逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，然后采用RNA擴增試劑盒通過實時定量PCR擴增cDNA。GAPDH為靶基因內參，采用2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達量。

1.6Westrn印跡 在不同組中，采用蛋白提取試劑盒提取肺組織中的總蛋白，然后用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度。以每孔加入50 μg的待測蛋白于十烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)-PAGE凝膠，110 V電泳后轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別加入兔抗小鼠AKT、p-AKT、Rac1和β-actin一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3×10 min，二抗37℃ 孵育1 h，TBST洗膜3×30 min，電化學發光(ECL)顯影。運用Quantity one 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作內參，計算相對表達量。

1.7統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量比較 與正常對照組比較，LPS組中肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量明顯增加(均P<0.05)。與LPS組比較，LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量明顯減少(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+ SDF-1α組肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量無明顯差異(均P>0.05)。見表1。

表1 各組肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量比較

2.2各組BAL中炎癥因子表達水平比較 與正常對照組比較，LPS組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達水平明顯升高(均P<0.05)。與LPS組比較，LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達水平明顯降低(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α表達水平無明顯差異(均P>0.05)。見表2。

2.3各組miR-126、AKT、p-AKT和Rac1表達水平比較 與正常對照組比較，LPS組miR-126表達水平明顯降低，p-AKT和Rac1表達水平明顯升高(均P<0.05)。與LPS組比較，LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組miR-126表達水平明顯升高，p-AKT和Rac1表達水平明顯降低(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+SDF-1α組miR-126、p-AKT和Rac1表達水平無明顯差異(均P>0.05)。AKT在各組間的表達水平無明顯差異(均P>0.05)。見表2。

2.4低表達miR-126對CTCE干預SP小鼠后肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量的影響 與LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組比較，LPS+CTCE+miR-126 inhibitors組中肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量明顯增加(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組肺毛細血管通透性、肺含水量和BAL細胞數量無明顯差異(均P>0.05)。見表3。

2.5低表達miR-126對CTCE干預SP小鼠后miR-126、AKT、p-AKT和Rac1表達水平的影響 與LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組比較，LPS+CTCE+miR-126 inhibitors組miR-126表達水平明顯降低，p-AKT和Rac1表達水平明顯升高(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組miR-126、p-AKT和Rac1表達水平無明顯差異(均P>0.05)。AKT在各組間的表達水平無明顯差異(均P>0.05)。見表3。

2.6低表達miR-126對CTCE干預SP小鼠后BAL中炎癥因子表達水平的影響 與LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組比較，LPS+CTCE+miR-126 inhibitors組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達水平無明顯升高(均P<0.05)。LPS+CTCE組和LPS+CTCE+miR-126-NC組BAL中炎癥因子IL-6、MIP-1α、MIP-2和TNF-α的表達水平無明顯差異(均P>0.05)。見表4。

3 討 論

SDF-1a能通過小肽類激動劑模擬其功能，CTCE作為SDF-1a的一種多肽類模擬物，具有更好的穩定性和更長的半衰期〔4〕。CTCE的性質類似于CXCL12，在體內能夠發揮多種生物學功能。研究顯示，在LPS誘導的多器官功能障礙綜合征中，CTCE能夠明顯降低IL-6和TNF-α表達水平〔5〕。同時在LPS 誘導的急性內毒素血癥中，CTCE具有抗氧化、抗感染和細胞保護作用〔5〕。這體現CTCE在抑制炎癥反應中發揮著重要作用。本研究結果提示CTCE和SDF-1α均能夠治療SP并抑制炎癥因子，并且CTCE和SDF-1α發揮的作用未見明顯差異。

miRNAs是一類非編碼的小RNA，長度只有20～24 nt，在生物體基因組中普遍存在〔6〕。目前研究證實，miRNAs只占所有RNA的1.0%左右，但能夠調控機體30%～50%的基因表達〔7〕。miRNAs在體內參與細胞增殖、分化、侵襲、凋亡和炎癥反應等多種細胞生物學功能〔8〕。隨著對miRNAs研究的深入，越來越多的證據表明，miRNAs參與SP中發揮重要作用〔9,10〕。研究顯示，CTCE能夠通過調控內皮祖細胞中miR-126、miR-125b、miR-34a和miR-155的表達水平抑制敗血癥的進展〔11〕。本研究結果提示CTCE或SDF-1α能夠明顯提高SP中miR-126的表達量而發揮作用。然而其作用機制尚未完全明確。

AKT是磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路中重要的轉導蛋白，在細胞生長、增殖、遷移和分化中發揮重要作用〔12〕。Racl是Rho超家族主要成員中的Rac亞家族，AKT是Racl上游分子，AKT/Rac1信號通路在炎癥反應中發揮著重要左右〔13,14〕。研究顯示，miR-126能夠通過調控AKT/Rac1信號通路參與敗血癥中的炎癥反應〔15〕。本研究結果說明在SP中AKT/Rac1通路被激活。為分析在SP中miR-126對AKT/Rac1信號通路的調控作用，在LPS+CTCE組中加入miR-126 inhibitors進行干預，結果提示CTCE通過促進miR-126的表達水平發揮SP保護作用和抑制SP中炎癥因子，miR-126能夠抑制AKT/Rac1信號通路的激活。

綜上，SDF-1a模擬物CTCE能夠通過上調miR-126的表達來抑制AKT/Rac1信號通路，進而對SP發揮保護作用。CTCE可能成為SP治療的重要藥物。