煙用添加劑生物學評價技術進展

李 源，韓亞偉，張東鵬，黃麗蘋，李欣欣

1 煙草制品添加劑概況

作為煙草工業的一種添加劑，煙用香精香料對于卷煙增香提味來說具有重要作用，是生產卷煙不可或缺的原料，香精配方屬于卷煙加工企業的核心機密之一，香精香料和其他添加劑的使用同一個卷煙品牌的創立與發展壯大息息相關。煙用香精香料是專門為卷煙加工企業生產的原料，一般不能用于其他非煙草企業[1]。

1.1 煙用香精香料分類

依據香料來源，通常將其分為天然的和合成的兩大類，目前己被發現的天然香料有4 000多種，合成香料更是多達8 000余種，合成香料中有一個種類稱為天然等同香料，指雖然在自然界中存在并己經被發現，但是由于自然界中的產量有限，主要采用人工合成的方法以供大量使用，目前煙草加工工業使用的多為此類物質。

1.2 煙用香精香料的作用

依據對卷煙制品的吸食品質貢獻，通?？蓪熡孟憔懔戏譃椴煌盗?，不同系列具有不同的作用。煙用香精香料的作用集中體現在降低煙氣危害組分和提高卷煙吸食品質這2個方面，合理添加煙用香精香料對卷煙制品的品質標準不可或缺，是形成卷煙風味和風格的重要因素[2]。

1.3 吸煙與健康

卷煙煙氣化學試驗數據指出，卷煙煙氣氣溶膠中已經得到確認的化學成分多達5 000余種。其中，60余種可以認定為致癌物，還有一些促癌物和輔助致癌物。1997年，Hoffhlann提出了所謂的Hofifllann名單，總結出了煙氣混合物中的一部分代表性危害組分，包含13類化學物質，共計44種[3]。

1972年研究顯示，低焦油煙卷對人體身心健康的影響程度相對較小。此后，眾多國家與地區推行了控制焦油和尼古丁含量的嚴格法律，如歐盟法律允許的單支最高焦油含量從1993年的15 mg到1998年12 mg，再到2004年的10 mg。再看我國，2002年底的時候，我國單支卷煙的焦油含量加權平均值為14.7 mg，2010年底時降到了11.5 mg；截至2017年5月，降到了10.3 mg， 含量8 mg以下低焦油卷煙全國銷量達到了創歷史的366.14萬箱，同比增長8.20%，并且含量6 mg以下的低焦油卷煙全國銷量達到了前所未有的58.10萬箱，同比增長10.94%[4]。

2 煙用添加劑生物學評價方法

安全性評價，就是從毒理學的角度，研究外源性物質對機體的毒理作用機理，檢測和評價該物質對機體的安全性和安全范圍，從而保持機體的健康。

目前，最常用的煙草制品安全性評價方法是對焦油量、煙氣一氧化碳量和煙氣煙堿量這三大指標的含量進行分析評測，這三大指標也是每年國家煙草專賣局用來衡量各個煙草工業企業煙草制品質量的重要參考依據，涉及煙用添加劑的生物學評價方法則比較少，這顯然是不全面的，煙氣一般都具有細胞毒性和遺傳毒性。

2.1 國外近年來生物學評價技術進展

半個世紀以來，國際四大煙草工業集團對卷煙和煙用香精香料的生物學評價方法進行了大量基礎性研究工作。從上世紀90年代初開始，雷諾煙草公司以Eclipse卷煙為試驗樣品，關于卷煙生物學評價的研究主要分為2個方面：①毒理學試驗。如體外毒理學試驗測定細胞毒性和遺傳毒性、核酸加合物分析、小白鼠皮膚外致瘤涂布試驗，以及小白鼠呼吸道系統（鼻子、喉嚨、肺葉）的病理解剖分析。②吸煙試驗。檢測分析志愿者的呼吸曲線，血液、尿液中的羥基血色素和尼古丁含量變化，觀察記錄肺部發炎癥狀。

英美煙草公司的生物學分析檢測方法為染色體畸變分析、中性紅細胞毒性分析、體外煙氣短期細胞毒性分析、細菌基因突變與回變——Ames分析、煙氣混合物中Hofifllann產物定量與分析和微核彗星試驗。

菲利普·莫里斯煙草公司的生物學檢測分析方法為周圍環境卷煙煙氣釋放量測定與分析、90 d亞慢性毒性分析、體外遺傳毒性及細胞毒性測定、臨床試驗和煙氣混合物代表性危害成分定量測定與分析等。

2004年10月10日—10月12日，卷煙產品及煙用香精香料生物學評價技術與低焦油煙草制品研發國際學術報告會在杭州舉行。會上，有關煙用香精香料生物學評價方面的論文有3篇，分別是考旺斯公司Clements博士的《體外毒理學評價煙用香精香料的實驗設計》[5]、英美煙草公司Messey博士的《煙用香精香料對于卷煙煙氣化學及細胞毒性的影響》和菲利普·莫里斯煙草公司德國漢堡研究實驗室Rmer博士的《體內測定分析煙用香精香料的生物學活性》。

2002年，國際煙草科學研究合作中心（CORESTA）成立了煙用香精香料體外生物學評價工作組，依據國際公認的體外生物學試驗測定程序并加以優化。通過廣泛的文獻閱讀分析和近4年的研究工作，工作組建立了3種評價煙草制品毒理學指標的試驗方法：①推薦使用鼠傷寒沙門氏菌突變試驗進行細菌誘變試驗；②推薦使用小鼠淋巴瘤細胞試驗或染色體畸變試驗或彗星試驗進行哺乳動物細胞遺傳毒性分析；③推薦使用中性紅細胞法檢測細胞毒性。

從國際上正在開展的煙氣化學生物學評價方法研究工作來看，3項生物學活性測定指標：①細菌誘變能力；②染色體致畸變能力；③細胞毒性大小已經得到了普遍應用。

2.2 國內近年來生物學評價技術進展

近年來，國內一些科研院校與卷煙工業企業充分合作，初步開展了一些有關安全性研究的生物學試驗。中國預防醫學科學院醫學研究與檢測中心（上海）已經公開發布了低焦油低危害卷煙制品（PREP）的某些試驗結果，主要有煙氣組分中巴豆醛和芳香胺含量分析，以及彗星試驗、Ames試驗、急性亞急性細胞毒性試驗、中性紅細胞試驗、總過氧化物酶檢測和小鼠3個月吸煙亞慢性體內毒性試驗。

云南中煙下屬的云南煙草科學研究院基于自身之前在毒理學領域的研究工作，組建了毒理學實驗室，這是煙草科研機構中的第1個，逐步探索出一系列靈敏、快速且適用于卷煙煙氣組分生物學安全性評價的試驗方法，確定了幾個煙氣毒理學評價的安全性指標，從宏觀和微觀2個層次上分別評價卷煙煙氣的安全性。建立了5種試驗方法用于研究卷煙煙氣混合物的3個重要毒理學活性指標——卷煙煙氣急性毒性、細胞毒性和遺傳毒性。系統地將細胞生物學技術應用于卷煙安全性評價中，這在國內是首次。建立了一系列卷煙煙氣生物學評價方法，該體系可進行10項指標的分析測定。由其自行設計并制造成功的小白鼠被動吸煙裝置，已獲得國家發明專利，可用于進行煙氣混合物對被動吸煙小鼠所造成的急性亞急性生物學試驗。

鄭州煙草研究院結合自身特長，充分利用資源，先后建立了一系列卷煙安全性評價體系。建立了卷煙主流煙氣冷凝物的Ames試驗方法，挑選對煙氣混合物敏感的TA98和TA100作為受試體，使用5%S9混合液作為活化系統，這樣一來，不僅使某些化合物的靈敏度得到了提高，試驗結果也變得更加可靠，新方法更加適用于復雜的卷煙煙氣混合物組分致回突變性的分析[6]。

來自中國軍事醫學科學院放射醫學研究所的朱茂祥高級工程師完成了大量的生物學評價技術研究，建立了一系列煙草制品生物學評價體系，主要有關于卷煙煙氣混合物中代表性危害成分和一些添加劑等的細胞活性檢測。朱茂祥研究員承擔的專項課題——卷煙煙氣安全性生物學評價技術，利用現代毒理學的原理和方法作為主要試驗手段，把卷煙煙氣混合物中的全部化學物質用劍橋濾片收集起來作為整體受試物，研制了卷煙煙氣動物染毒裝置和卷煙體外毒理學主流煙氣暴露裝置，評價卷煙煙氣的急性和長期毒性、致突變能力、致畸畸變能力和致癌作用，以及其他毒理學試驗[7]。

2.3 實驗室煙草毒理學試驗技術進展

實驗室成立于2010年3月，以學院食品安全研究工作為基礎，結合煙草制品安全性評價的需要，整合資源，隨省局共建煙草工業生物技術重點實驗室的成立而逐步發展和完善，建有裝備齊全的細胞培養室，主要利用分子生物學和細胞生物學實驗技術開展研究，預期建立體內體外相結合的毒理學評價技術體系。目前已完成的試驗成果主要有：4種煙草重金屬離子通道蛋白轉錄組的分析及應用研究，建立了小白鼠活體毒理學評價模型，建立了全煙氣及煙草特有亞硝胺動物毒理模型[8]，建立了全煙氣致小鼠肺損傷模型[9]，研究了NNK對V79和NCTC 1469 2種細胞增殖和凋亡的影響。

3 煙用添加劑安全性評價技術前景與展望

目前，香精香料的使用與否主要看其燃吸時對香氣質和香氣量的貢獻，較少考慮其毒理學評價，對于煙用添加劑的安全性標準，世界范圍內也還沒有統一的準則與規定。但是，煙用香精香料在煙草制品中的應用相當廣泛，而且煙用添加劑種類繁雜，含量指標不具備可視性，加入煙草制品后對產品的穩定性和質量影響不好預測。因此，進行香精香料的毒理學研究試驗對于合理使用煙用香精香料具有深遠意義。在吸煙與健康這兩者矛盾之間找到適當的平衡點不僅僅是煙草毒理學研究的重大目標，對于煙草工業的長遠發展也關系密切。

隨著我國經濟市場對外開放程度的增加，外國煙草公司必將更加廣泛地參與到煙草行業中來，民族卷煙工業面臨的競爭將更趨激烈。進行煙草毒理學研究，明確煙氣危害成分和毒理機理，開發新型低危害高香氣卷煙制品，提高中式卷煙品牌價值，進而在激烈的國際競爭中獨占鰲頭。

[1]吳維佳.煙用香精香料對卷煙安全性的影響 [D].長沙：湖南農業大學，2010.

[2]吳維佳.煙用香精香料的細胞毒性研究 [J].湖南農業科學，2010（9）：91-93，98.

[3]Hoffmann D，Djordjevic M V，Rivenson A，et al.Relative potencies of tobacco-specific N-nitrosamines as inducers of lung tumours in A/J mice[J].Cancer letters，1993 （1）：25-30.

[4]朱茂祥.中式低危害卷煙的毒理學評價技術 [G]//中式卷煙理論內涵討論論文匯編.北京：國家煙草專賣局科技教育司，2004.

[5]Clements J.Study design consideration for in vitro toxicity assays on ingredients[G]//煙草制品及卷煙添加劑安全評價與低潛在性危害卷煙產品開發國際研討會會刊.杭州：國家煙草專賣局，2004.

[6]聶聰.卷煙安全性評價體系的建立（2） [J].中國煙草學報，2011（4）：102，

[7]王永超，賈夢珠，程生博，等.煙草石油醚含量研究[J].農產品加工，2017（6）：51-52，55.

[8]寧維.全煙氣及煙草特有亞硝胺在小鼠中的安全性研究 [D].鄭州：河南農業大學，2014.

[9]寧維，陳利平，李瑜，等.全煙氣致小鼠肺損傷模型的建立 [J].煙草科技，2013（11）：36-40.◇