食源性致病菌的檢測技術研究進展

蘇粉良，李冰燕，陳雨欣，周 雯

（1.蘇州大學醫學部，江蘇蘇州 215006；2.蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇蘇州 215004）

0 引言

食品安全是全世界共同關注的公共衛生問題，由細菌導致的食物中毒的數量占各種食物中毒之首，食源性疾病已經成為危害食品安全最主要的原因之一[1-2]。常見的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌、出血性大腸桿菌O157∶H7、空腸彎曲菌、阪崎克羅諾桿菌等。這些致病菌在食品中存活、生長代謝引起食品變質，同時有些致病菌分泌有毒物質，直接或間接導致患病。因此，應用準確有效的檢測技術來控制食源性疾病的流行具有非常重要的公共衛生學意義。

1 食源性致病菌的檢測方法

1.1 傳統的細菌培養技術

作為食品微生物檢測的“金標準”，傳統的細菌培養技術在食源性致病菌檢測方面具有舉足輕重的作用。目前，食品安全國家標準里均有致病菌傳統的培養鑒定技術要求。其基本原理為稱取一定數量的待檢樣品，通過（選擇性）增菌液富集培養，后劃線分離到選擇性培養基，觀察菌落形態。挑取典型菌落染色鏡檢、做后續的生化鑒定和血清學分型。隨著生物技術的不斷發展，靈敏度高、特異性強顯色培養基投入到檢測過程，有效提高了篩選效率。在后續的生化鑒定過程中，全自動微生物鑒定分析系統的使用可以簡化試驗步驟、縮短試驗周期，并且能更高效地得出試驗結果。

但是，傳統的細菌培養技術試驗周期比較長、步驟比較繁瑣，在突發公共衛生事件中該技術無法做到高通量快速檢測，不能起到有效的監測、預防作用，并且在試驗結果的判定方面對檢測人員的要求比較高。此外，對于一些在食品加工過程中受損的致病菌（活的不可培養狀態）、持留菌、休眠菌及代謝異質菌來說，傳統的細菌培養技術還是存在一定的缺陷，會導致這種類型致病菌的漏檢[3]。

1.2 免疫學技術

免疫學技術是指抗原與相應抗體特異性結合會產生相應的信號，通過監測該信號來判斷待檢樣本中是否有目標物質。

1.2.1 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗應用了抗原抗體之間特異性反應的原理，在檢測過程中通過酶標抗體（抗原）催化底物顯色來對待檢樣品進行定性或定量分析。多名專家應用該方法對不同的細菌進行試驗研究，結果表明酶聯免疫吸附試驗能在24 h內檢測多種食源性致病菌。例如，應用酶聯免疫吸附原理制造的mini-Vidas全自動免疫分析儀可在1～2 d內快速篩檢沙門氏菌、大腸埃希氏菌、單核細胞增生李斯特菌和空腸彎曲菌等[4]。

1.2.2 免疫層析技術

免疫層析技術以固定有檢測限和控制限的條狀纖維層材料為固定相，測試液為流動相，由于毛細管作用原理，樣品溶液在層析條上泳動，當樣品移動到包埋有抗體的地方時，樣品中相應的抗原就會與該抗體發生特異性結合發生免疫反應，通過酶反應或者是直接運用可目測的標記物（如膠體金、彩色乳膠等）得到試驗結果。免疫層析技術包括膠體金免疫層析技術、碳納米顆粒免疫層析技術、熒光微球免疫層析技術和量子點免疫層析技術[5]。其中，膠體金免疫層析技術是在20世紀80年代初發展起來的，具有快速、簡單、低價、適應性廣等優點[6]，適合基層單位進行各種食源性致病菌的快速篩查。國內外不少人研制膠體金試紙條，并用于食源性致病菌的檢測[6]。黃嶺芳等人[7]用該方法檢測食品中的大腸桿菌O157，最低檢測限為1×104CFU/mL。

1.2.3 免疫磁珠分離技術

免疫磁珠分離技術是將特定致病菌的抗體偶聯到磁珠微球上并通過抗原抗體反應形成磁珠，通過外部磁場磁力的作用，將目標致病菌分離出來的技術。目前，免疫磁珠分離技術可以與多種技術聯合使用來實現對食源性致病菌的快速檢測[8]。比如，結合顯色培養基分離技術、PCR技術、免疫學技術、電化學技術、流式細胞儀分析等，這樣不僅可以節省檢測時間，還可以對樣品進行高通量篩檢。隨著免疫磁珠分離技術的不斷發展，目前研發人員已經建立了一些不需要擴增培養就可以檢測目標菌的技術方法，時間可以控制在3 h以內，從而真正地實現了致病菌快速檢測[9-11]。

1.2.4 其他免疫學技術

除以上3種免疫學檢測技術以外，免疫擴散技術、免疫熒光技術、免疫印跡技術、乳膠凝集法等都在食源性致病菌檢測中有所應用[12]。

免疫學技術具有特異性好、效率高、檢測成本低、不需要大型儀器等優點，但是當待檢食品中含有目標菌的競爭性物質時則很有可能出現假陽性結果，靈敏度不高，這些因素限制了免疫學技術在食源性致病菌檢測中的廣泛應用。

1.3 分子生物學技術

分子生物學檢測技術的發展，為食源性致病菌生物快檢工作提供了良好的技術平臺。

1.3.1 聚合酶鏈式反應技術（PCR技術）

PCR技術檢測食源性致病菌是指將目標菌DNA為模板，先經高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應條件下，根據模板序列設計的2條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應的一段互補序列發生退火而相互結合，接著在DNA聚合酶的作用下以4種脫氧核糖核酸（dNTP） 為底物，使退火引物得以延伸，然后不斷重復變性、退火和延伸這一循環，使目標菌的DNA擴增，然后通過電泳檢測PCR產物是否有特征條帶，從而實現為目標菌的快速檢測。近年來，用PCR技術在食源性致病菌領域發展很好，檢測方法也多樣化，如普通PCR、實時熒光定量PCR、逆轉錄PCR和電化學發光PCR[13]等，也可將幾種方法結合使用[12]。目前，國內有很多PCR方法已經變成檢測標準，以出入境檢驗檢疫行業標準為多。

1.3.2 生物芯片技術

生物芯片技術是由生命科學與微電子學等學科相互交叉發展起來的一門高新技術，生物芯片直接檢測致病菌的DNA，可以解決復雜樣品中存在酶抑制物的問題，與傳統的生物檢測技術相比具有信息量大、處理快速、所需樣品少、污染少等優點[14]。目前，生物芯片技術應用最成功的是基因芯片。

應用基因芯片檢測致病菌原理是基于細菌的16S rRNA基因的高度保守性。由于16S rRNA基因的長度最合適，是目前最常被選用作細菌的分類和鑒定的基因[15]。李君文等人[16]曾經用基因芯片檢測水中常見的致病菌，并可對水中致病菌實行高通量檢測，通過一次試驗可以得出全部結果。

1.3.3 DNA探針技術

DNA探針是經過某種標記物（放射性同位素、酶、熒光素、化學發光物、鑭系元素等） 標記過的單鏈DNA[17]，它在體外合適的條件下按照堿基互補配對的原則，與靶DNA形成雜交DNA分子，通過檢測雜交信號來判斷樣品中是否含有待測致病菌。通常選擇待測致病菌的特異性保守基因序列為目標DNA，并以其互補DNA序列為雜交探針。DNA探針的特異性，保證了檢測結果的高度特異性[18]。

分子生物學技術特異性強、靈敏度高、操作簡單快速等優點逐漸被人接受，但是不可忽視的是該技術容易出現假陽性和假陰性，而且儀器和試劑耗材費用較大，另外操作人員需要經過專業培訓上崗等因素限制了其廣泛應用。

1.4 生物傳感器技術

生物傳感器技術是一種由生物、化學、物理、醫學、電子技術等多種學科互相滲透形成起來的高新微量分析技術生物。生物傳感器主要由生物分子識別元件和信號轉換元件2個部分組成，其基本原理為:當待測物與分子識別元件特異性結合后，所產生的復合物（或光、熱等）通過信號轉換器轉變為可以輸出的電信號、光信號等，從而達到分析檢測的目的[19]。通過生物傳感器技術，能夠檢測出食品中低濃度病原菌，并且適合對食品進行實時監測[20]。該技術已經被用到食源性致病菌的檢測工作當中。Luo Jinping等人[21]曾用生物傳感技術來檢測牛肉汁中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌；2002年，Tahir Z M等人[22]采用電化學免疫傳感器技術在10 min內完成大腸桿菌O157∶H7的檢測分析，并且精度達到10 CFU/mL；2014年，葉雪梅等人[23]用生物傳感器檢測食品中的沙門氏菌，并做了傳感器持久性的研究。武會娟等人[24]采用免疫生物傳感器檢測食品中的單增李斯特菌，花費時間4.5 h，檢出濃度達100 CFU/孔。

生物傳感器的好處是需要的檢測樣本量少、檢測結果靈敏度高、重復性好。但是目前仍處于研究階段，且檢測費用高，不利于推廣[25]。

1.5 代謝學檢測技術

代謝學檢測技術的原理是在培養基中繁殖食品微生物，通過研究其在代謝過程中產生的特異物質、分子等變化特征，間接獲取食品微生物量化結果。代謝學檢測技術包括三磷酸腺苷（ATP） 生物發光法、電阻抗技術、微量生化法。

1.5.1 ATP生物發光法

ATP是細胞內必需的一種代謝產物，在一定條件下細胞內ATP含量比較穩定，因此通過測定細菌的ATP含量可間接計算出樣品中的活菌數。該法常用來檢測活細菌總數，反映食品受污染的嚴重程度，具有簡便、省時、快速等特點，還可以被用于大量食品樣本中菌污染情況檢測和食品現場快速檢測等。但是，若樣品中含有大量非細胞性ATP，則檢測結果可受干擾[26]。

1.5.2 電阻抗技術

電阻抗技術是根據微生物在培養基中代謝活動的不同，通過電阻抗測量法對微生物進行鑒定的技術。工作原理為：細菌在生長繁殖過程中，會把培養基中的大分子物質，如碳水化合物和蛋白質等代謝為小分子的乳酸鹽和氨基酸等，培養基的導電性就會隨之發生變化，因此可以通過檢測培養基導電性的變化情況來判斷細菌在培養基中的繁殖特性[27]。目前，電阻抗法已被AOAC接收，適用于檢測食品中的病原體，目前可用于食品中細菌總數、大腸桿菌和沙門氏菌等的檢測，該方法較常規方法敏感、快速，而且特異性高、重復性好[28]。

1.5.3 微量生化法

微量生化法包含微熱量技法、放射測量法等。微熱量技法是指通過測定細菌生長代謝時的熱效應來檢測細菌，可以通過熱量變化來鑒別菌種；放射測量法原理是細菌在生長繁殖過程中代謝含14C標記的碳水化合物進行并釋放出含有放射性的14CO2，然后通過測定放射性的14CO2含量而測定食源性致病菌。Previte J J[29]曾經應用放射測量技術來檢測食品中微生物，由于該方法應用到了放射性物質，在應用上有很大的限制。

1.5.4 基于氣味指紋技術的電子鼻方法

微生物在代謝過程中會產生特定的代謝產物，不同的微生物，其產生的揮發性代謝產物往往不同。但是，它們一般具有種屬特征，因此可以根據這些氣味物質和由它們組成的氣味指紋圖譜來進行不同微生物的鑒定與檢測。由于該方法主要是針對微生物的揮發性代謝產物，因此對樣品沒有什么特殊的要求。除了檢測迅速、靈敏度高外，該法最主要的優點是無需對樣品進行任何處理,因此在微生物無損檢測方面具有很好的應用前景[30]。

1.6 其他檢測技術

隨著現代生物技術的不斷發展，先進儀器的使用也為食源性致病菌檢測提供了良好的技術平臺。其中基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）是最近發展起來的一種鑒定食源性致病菌的儀器。目前，已有許多應用MALDI-TOF-MS技術進行食源性致病菌鑒定的相關報道。有人曾應用MALDI-TOF-MS技術成功鑒定區分了金黃色葡萄球菌、致瀉性大腸埃希氏菌、志賀氏菌、黏質沙雷氏菌、腸炎耶爾森氏菌、芽孢桿菌屬等31株常見食源性致病菌。

流式細胞術是能夠用來快速檢測液相中懸浮粒子多種物理特性的一種現代分析方法。因其具有分析速度快和靈敏度高等優點，該方法正逐漸被應用于食源致病菌的檢測。但是該方法使用的試劑成本高、人員技術難度大、受檢樣品局限，難以普及推廣，因此目前只適用于科研和醫療機構[31]。

2 結語

食源性致病菌檢測是食品安全的一個重要方面，隨著生物技術的不斷發展，食源性致病菌檢測技術也在不斷地出現。在實際的食品檢測過程中，使用最為廣泛的還是傳統的培養鑒定技術，同時也會使用一些快速檢測手段，如VITEK，mini-vidas等儀器或生化鑒定試劑條等輔助檢測。快速檢測手段可以用于突發的公共衛生事件或者是批量化篩檢。在快速檢測技術中，分子生物學技術中的PCR技術是目前研究的最深入、最成熟的檢測技術，應用得也較為廣泛，該方法已經有相應的國標[32]。免疫學技術主要以試劑盒或是試紙條等產品的方式應用于檢測工作，但是由于其靈敏度不高等缺點沒有得到廣泛的應用。其他一些快速檢測技術仍處于試驗研究階段，并未得到推廣應用。綜合來看，每種檢測技術都有其自身的缺陷，但是隨著多種學科的共同發展，多種檢測技術聯合使用將會大大提高檢測的準確性，縮短檢測時間，在食源性疾病的預防和控制的方面發揮至關重要的作用。

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