發酵中草藥在水產養殖中的應用

孟 彬，孫敬鋒，呂愛軍

( 天津農學院 水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384 )

中草藥作為我國傳統瑰寶，經過幾千年的傳承，其藥用價值在每個社會時期都曾得到廣泛認可[1-2]。古代沒有化學藥物和抗生素，中草藥是唯一可選擇的藥物，對于當時的疾病防治起著至關重要的作用[3]。時過境遷，即使在醫學水平相對發達的當代，某些疾病的治療也會選擇中草藥作為輔助治療藥物，且有事半功倍的效果。

19世紀中葉，國外許多科學家開始對魚類的寄生蟲病進行相關的描述記載，并且逐漸開始研究魚病的預防治療方法[4]。直到20世紀，世界范圍內才開始針對水產動物疾病進行相關系統研究，其中包括病原生物的鑒別、分類、致病性、防治等方面，并且在這個過程中逐漸積累了豐富的理論和實踐經驗。在我國，相關研究在20世紀50年代后逐步開展，并且在魚類的細菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲病、病毒性疾病等方面取得了一定的成果，在一定程度上解決了生產過程中魚類疾病的問題[5]。隨著近年來經濟的飛速發展，我國已經從傳統的粗放型養殖開始逐漸向集約化養殖模式過渡。但目前在水產養殖動物疾病防治過程中，對抗生素的依賴程度依然很大。抗生素的使用不但使病原微生物產生了耐藥性，也會導致殘留藥物在動物體內和水體中蓄積，嚴重降低了水產品品質，污染了養殖環境。

2006年歐盟頒發了相關的禁令，禁止整個歐盟區在畜牧及水產品養殖過程中使用抗生素，同時加強了對進口水產品抗生素殘留的篩查力度，并且還抵制其他國家添加抗生素的產品向歐盟輸送。我國農業部也曾經頒發《水產養殖質量安全管理規定》[6]，其中要求進行無公害綠色養殖，并且鼓勵開發新的抗菌藥物對原有化學藥物和抗生素進行替代。中草藥在我國水產動物疾病防治過程中的研究有廣泛的記載[7-11]。中草藥大部分都來源于自然環境，具有藥用價值高、功能顯著、副作用小等優點[12-13]。但是，傳統的物理化學方法提取中草藥有效成分，往往會破壞其活性成分，造成有效成分的活性大大降低，限制了中草藥產業的發展。隨著現代生物技術的突飛猛進，結合生物技術，尤其是酶工程、發酵工程等，將有益微生物和傳統中草藥相結合，不僅可以發揮中草藥的作用，還可以發揮微生物的作用，二者作用相輔相成，在疾病防治、環境保護、環境修復過程中均可以發揮一定的作用。

1 生物技術在發酵中草藥中的應用

隨著科學技術的蓬勃發展，傳統中草藥炮制工藝的弊端逐漸暴露出來，如中草藥活性成分提取不徹底，導致藥物起效時間較長，藥用價值發揮不完全。某些中草藥具有一定的毒性，嚴重限制了部分中草藥的使用，或者使用后產生一些毒副作用。如用麻黃治療呼吸道疾病時，麻黃中的麻黃堿會導致人體心臟機能亢進。雷公藤具有清熱涼血、活血化瘀的功效，但是這種草本植物有毒性，長期均作為殺蟲劑使用，無法將其藥用價值完全利用[14]。這些因素至今是中草藥發展過程中無法突破的瓶頸。

現代發酵方法可以分為液體深層發酵和固體發酵兩種,液體深層發酵不僅可以分離到菌絲體，而且生產量大、周期短、設備占地少; 固體發酵所需要的設備簡單，發酵條件易控制，培養物中所有的營養物質和保健成分都可以被利用[15]。20世紀80年代，莊毅[16]創立了中藥的雙向發酵法，將具有活性成分的中藥作為藥性基質，被藥用真菌發酵得到的產物稱為藥用菌質，整個發酵過程中會產生一系列復雜的生理活動和生化反應，產生新的活性成分和新的功能。中藥不僅能提供真菌所需營養大量產生菌體，同時又能因真菌的酶而改變中藥的原有結構，轉化為具有活性更強、毒性更低或生物利用度更高的新的化學成分，這就是新型的雙向性固態發酵技術，無需將藥用真菌與次級代謝產物分離，二者共同使用，協同發揮藥效。發酵中草藥的目的是為了使有效成分最大程度地被釋放出來，并且增強其原有的性能，促進藥物活性成分被更好吸收利用[17]。微生物的分解轉化能力強大，并且其次級代謝產物也十分豐富[18-19]。利用微生物的生長代謝與其生命活動來轉化中草藥，與傳統中草藥炮制學的化學方法和物理方法相比有以下優點：提高某些難以被直接利用成分的利用率，改變藥物活性，縮短藥物產生作用的必要時間，提高藥效，降低毒副作用，擴大藥物的適應癥等[20]。微生物發酵的條件通常都是十分溫和的，因此可以在最大程度上避免中草藥中的活性成分在發酵過程中被破壞，可以最大程度提取到活性高的有效成分，使得藥物在最大程度上發揮其藥用價值。

在我國，中草藥的生物轉化研究起始于20世紀80年代，并且隨著科學技術的發展，相關的研究也在不斷深入。我國學者利用發酵工程技術，提高了靈芝、冬蟲夏草等藥用植物中多糖的含量，最大程度上發揮了這些珍稀藥用植物的價值[21]。通過發酵技術對中藥中有效成分的提取工藝進行改進后，降低了提取難度。有研究報道，利用自制復合酶對三七總皂苷、三七莖葉總皂苷等系列中藥有效成分進行酶法轉化，結果表明，復合物酶能高效的將藥材中部分皂苷成分轉化為低極性皂苷[22]。此外，戴燊等[23]研究發現，中草藥經過發酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等營養成分含量都有了不同程度的提高。王身艷等[24]研究發現，雙向發酵后，白芍藥苷及芍藥內酯苷含量顯著下降，產生了新的物質。

2 發酵中草藥的優勢

2.1 減毒增效

中草藥的種類分為植物型、動物型、真菌型等。近年來，水產養殖過程中主要以植物型中草藥作為添加劑居多。中草藥中含有豐富的蛋白質、脂質、糖類、維生素、氨基酸等營養物質。微生物在生長繁殖過程中主要消耗動植物的一些蛋白、糖類等物質。中草藥經過生物轉化后，使得原有的一些不易被吸收的大分子物質降解為小分子物質，極大程度提升了吸收利用率。這些小分子物質在機體內代謝速率快，使得藥物的分解過程更為徹底，并且機體可以充分吸收這些物質，有利于增強藥效，大大提升中草藥的利用率。同時，發酵可以減少原料中草藥的用量，有效地節約了成本[25]。陳永強等[26]的甘草微生物發酵試驗結果顯示，微生物發酵可有效破壞分解甘草細胞壁，促進甘草中有效成分釋放，發酵次生產物甘草次酸，可被腸道直接吸收，迅速作用于靶部位，對急性抗炎鎮痛效果顯著。

另外，發酵技術可以利用微生物對某些藥物中的有毒物質進行分解，有效擴大了這些藥物的藥用價值，豐富了疾病防治過程中可選擇的藥物種類。張普照等[27]在研究中發現，利用藥用真菌發酵雷公藤后，明顯降低了其自身的毒性，但對藥物活性的影響很小。董玫等[28]將肝癌細胞H22移植到健康小鼠體內，分別喂食傳統煎制的六味地黃液和發酵六味地黃液。結果喂食發酵六味地黃液的患癌小鼠體內腫瘤細胞的增殖和生長受到了明顯的抑制，但喂食傳統煎制六味地黃液對受試小鼠體內的腫瘤細胞并沒有明顯抑制作用。馬錢子在治療跌打損傷、骨痛、癱瘓時有一定的功效，但是這種藥材毒性也較強，臨床上的治療劑量接近中毒劑量，安全范圍較小[29]。潘揚等[30]利用“雙向發酵”技術發酵馬錢子，結果顯示，馬錢子中毒性最強的成分馬錢子堿和士的寧的含量均有明顯降低，但是發酵并沒有影響馬錢子原有的抗炎、鎮痛功效，推測發酵技術在減小有毒中草藥毒性的過程中不會改變原有的藥用活性成分。

2.2 產生新的物質

中草藥經過益生菌發酵后可以產生生物堿、有機酸等抑菌物質，這些物質進入機體腸道中可以有效抑制有害致病菌的繁殖生長。同時，中草藥中所含有的黃酮、皂苷、核苷酸、葉酸、多糖等活性成分本身也是益生菌生長所需要的活性成分，二者相輔相成構成了一個有機整體[31]。而且，部分中草藥在發酵過程中，微生物代謝所產生的酶類與特定的底物相結合可以產生新的活性物質，在原有藥材的固有藥物價值基礎上附加了一些新的藥用價值，有效擴大了藥物的使用范圍及途徑。王玉紅等[32]向靈芝發酵液中加入黃芪，發現發酵液中多糖成分發生了變化，提示可能有新物質產生。李國紅等[33]用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)發酵三七根須，結果顯示產生了5種新物質。張敏等[34]發酵大豆制作中藥淡豆豉，結果顯示，發酵后的淡豆豉中苷元成分增高，糖苷成分降低，表明發酵后的原料大豆的糖苷配基發生了解離，可以得到游離的苷元，并且產生了一種新的纖溶性較好的纖溶酶，提升了淡豆豉的藥用價值。金玲等[35]對決明子進行發酵，觀察發酵前后5種蒽醌類成分的變化，發酵后大黃酚和大黃素甲醚增加至發酵前的2.15倍和1.34倍，蘆薈大黃素、大黃酸的含量也有一定程度的增加，多數游離型蒽醌含量呈上升趨勢，推斷發酵有利于增加決明子中蒽醌苷元的含量。張棟健等[36]對傳統中藥枳殼進行發酵，比較同一批次的枳殼以及其炮制產物的超高效液相色譜，發現發酵后的枳殼圖譜中出現了兩個新的色譜峰，提示有新物質產生。杜晨暉等[37]按照一定比例將葛根黃連湯制成培養基培養酵母菌，觀察發現，葛根黃連湯中酵母菌可以正常生長并且培養基干質量有所下降，表明酵母菌發酵過程中很可能利用了葛根黃連湯中的蛋白質、纖維素、淀粉等營養物質。進一步研究發現，發酵后的葛根黃連湯中的總黃酮和總生物堿含量均有一定程度的增加，推測很可能是因為發酵過程中酵母菌所產生的的纖維素酶、果膠素酶、糖苷素酶等降低了細胞壁對藥物有效成分溶出的阻礙，進而增加了葛根黃連湯的有效成分。中藥發酵是一個復雜的過程，微生物經過發酵產生許多酶類，如單寧酶、果膠酶、淀粉酶等，在酶類物質作用下，某些藥用成分發生分解轉化，從而產生新的藥用成分。另外，中藥影響微生物的生長代謝，進而改變微生物的代謝途徑，產生新的代謝產物，最終使中藥各組分成分的含量發生變化[38]。

2.3 協同發揮作用

發酵中草藥所選取的微生物大多是一些益生菌。益生菌可以促進中草藥在腸道中的消化吸收率，中草藥中的藥用活性成分可以促進腸道益生菌的增殖[39]。一些中草藥中有機酸含量很高，這些有機酸被人類或其他動物攝食后進入腸道，有利于保持腸道弱酸性的微環境。這種弱酸環境在抑制有害微生物繁殖的同時促進了有益微生物的繁殖，腸道菌群處于穩定狀態，使得中草藥中活性成分更容易被充分吸收。另外，微生物具有一種“破壁作用”，使得中草藥中的營養成分更容易被充分利用，促進了中草藥中有效成分在機體中的代謝和運輸，在提高藥效的同時減少了藥物的使用量[40]。中草藥往往都含有一類活性物質稱為生物堿。生物堿是一種廣泛存在于中草藥中的含氮有機化合物，是中草藥中的一類很重要的化學成分，對于疾病的防治起著重要的作用[41]。但是，生物堿類物質的存在導致傳統煎制和提取出的中藥液有很強烈的苦味，在一定程度上限制了中藥液的利用。利用微生物發酵中草藥，某些可以產酸的益生菌所產生的酸可以中和生物堿，降低了中藥液中的苦味，改善了口感，增加了中草藥的利用率。但是藥效是否會發生改變，還需要根據不同類型的中藥以及益生菌設計不同的藥理模型，并且對成分提取后進行相關的研究來證明[42]。

3 發酵中草藥在水產養殖中的應用效果

3.1 提高誘食率，促進生長

3.2 增強機體抗病力

中草藥含有種類豐富的藥用活性物質，如多糖、有機酸、生物堿、皂苷、揮發性油等，在這些物質的作用下，中草藥即使單獨作為水產動物免疫制劑使用也有很好的效果[48-50]。但是，中草藥中有些大分子活性物質不易被機體吸收，通過微生物降解成小分子物質，有利于水產動物的吸收利用，可以最大程度提高利用率，并且可以去除一些大分子雜質，有效增強藥效[51-52]。通過發酵技術加工處理后的中草藥制劑可以保留原有的藥物活性、增加其含量，增強中草藥藥理作用。具發酵作用的益生菌可以分泌抑菌物質，也可以通過爭奪營養或附著位點來抑制病原微生物的生長。此外，這些益生菌具有甲基化、羥基化、氧化等強大的生物轉化能力，中草藥經過發酵后，其有效成分得到更加充分的分離、提取，增強了藥物的活性。同時，在大量活性酶的協助下，有利于發酵中草藥制劑被機體快速吸收，在疾病防治、免疫調節等方面充分發揮天然藥物和益生菌獨特的優勢,這都是在益生菌協同下完成的[53]。趙倩等[54]用嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)對鯉魚進行攻毒試驗，觀察一周后發現，死亡率為基礎飼料組>中草藥組>酵母菌發酵中草藥組>枯草芽孢桿菌發酵中草藥組，進一步研究發現，與喂食基礎飼料的對照組相比，喂食發酵中草藥制劑后，魚體溶菌酶活力上升，谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐的含量均有所下降，說明添加發酵中草藥制劑可以提高鯉魚的免疫保護率和溶菌酶活力，進而達到提高魚體免疫力的作用。Muona等[55]研究發現，血漿中溶菌酶活性變化在一定程度上與循環系統白細胞數目變化呈正相關。湯菊芬等[56]在研究吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)免疫保護率時，設置了5個試驗組。其中對照組僅添加了基礎飼料，其余組在基礎飼料基礎上又添加了中草藥、益生菌制劑、復合益生菌制劑、發酵中草藥制劑。結果表明，中草藥和益生菌在單獨作用時，對羅非魚的免疫保護率均有所提高。但是添加發酵中草藥制劑試驗組明顯優于其余4組，結果表明，無論是中草藥還是益生菌制劑對于提高羅非魚抗病能力均有顯著作用。發酵不僅將益生菌和中草藥進行了有機結合，同時最大程度上發揮了它們在增強免疫力方面的積極作用。謝炎福[57]在研究鯽魚出血病的過程中發現，對病魚分別投喂發酵中草藥制劑和單獨的復方中草藥制劑進行治療，結果顯示，添加發酵中草藥制劑組中鯽魚(Carassiusauratus)的成活率要優于單獨添加復方中草藥制劑的對照組，表明發酵中草藥對于鯽魚出血病的治療有顯著作用。進一步分析試驗結果發現，達到相同治療效果時，試驗組中發酵中草藥的添加量小于對照組中未發酵中草藥的添加量，說明發酵技術可以提高藥物利用率，節約成本。

3.3 凈化水質，改善水產品品質

4 展 望

目前，發酵中草藥制劑的研究尚處于起步階段，對于發酵條件、菌種選擇、培養基的選擇都亟待進行相關研究。在開發發酵中草藥制劑的過程中要充分考慮以下因素：首先，水產動物適應的鹽度不同而分為淡水水產動物和海水水產動物，在開發過程中應當根據鹽度的差異選擇不同的益生菌和中草藥復方制劑，最大程度發揮有益效果。其次，根據水產動物的種類及需求不同，選擇不同配比的發酵中草藥制劑。最后，提取發酵后的中草藥活性物質后應做相應的分析。雖然目前沒有發酵中草藥會產生毒性物質的報道，但是應不斷研究，對可能含有毒性或功能不確定的活性成分加以分析、論證，真正創造出新型安全、綠色的添加劑。

發酵中草藥制劑為新型制劑，含有中草藥、益生菌的特點，使用后無殘留。不僅能改善藥用活性，發揮功效，其中的益生菌在進入腸道后可以發揮自身特點促進制劑的吸收。應用這種制劑可以降低養殖過程中抗生素的使用，推進無公害養殖的發展。

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