福爾馬林防治大黃魚刺激隱核蟲病的研究

江 飚，王 晶，羅恒利，陳 佳，李國清，李安興

( 1.中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275； 2.華南農業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642；3.寧德富發(fā)水產有限公司，福建 寧德 352002 )

刺激隱核蟲(Crytocaryonirritans)寄生于熱帶、亞熱帶海水硬骨魚類的皮膚、鰭、鰓、眼角膜等處，形成大量小白點，可造成魚的鰓和皮膚損傷及功能障礙[1-2]。其生活史包括4個階段：滋養(yǎng)體、包囊前體、包囊和幼蟲。在水溫24～27 ℃時，滋養(yǎng)體生長期為3～7 d，成熟后脫離宿主，形成包囊前體；包囊前體沉于水底后黏附于附著物上，逐漸形成厚的囊壁進入包囊階段；包囊經歷一系列的不對稱二分裂，每個包囊可分裂成200～300個子代幼蟲；發(fā)育成熟的幼蟲從包囊逸出，在水中快速游動，尋找和感染宿主進入下一個生活周期[2-3]。刺激隱核蟲世代周期短，繁殖率高，大規(guī)模爆發(fā)時可導致海水養(yǎng)殖魚類的大量死亡，造成嚴重的經濟損失[4]。

大黃魚 (Pseudosciaenacrocea) 是我國東南沿海海域主要的經濟養(yǎng)殖魚類[5-6]，近年來隨著海水漁業(yè)集約化程度和養(yǎng)殖面積的提高，海區(qū)的養(yǎng)殖密度增大，造成大黃魚刺激隱核蟲病頻發(fā)，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來很大的困擾[7]。目前，在大水體的開放型養(yǎng)殖漁場中，暫無有效防治刺激隱核蟲病的方法，而在小范圍養(yǎng)殖中，多采用物理和化學方法防治刺激隱核蟲病，如用淡水浸泡、輪換養(yǎng)殖、紫外線、臭氧、化學藥物等方法處理養(yǎng)殖水體中的寄生蟲進行防治[8-11]。利用免疫方法預防刺激隱核蟲病是一個理想的方法，可以使魚獲得較好的免疫保護，但因為疫苗所用的幼蟲不能體外培養(yǎng)，難以大量獲得，這種方法現在還難以大規(guī)模應用[12]?；诔杀竞椭委熜Ч?，室內大黃魚育種和暫養(yǎng)過程中爆發(fā)刺激隱核蟲病，主要通過福爾馬林浸泡治療。

福爾馬林具有防腐殺菌性能，其發(fā)揮作用主要通過與蛋白質的氨基結合而使蛋白凝固[13]。在水產養(yǎng)殖系統(tǒng)中，福爾馬林因能夠通過水生生物代謝，保持低生物累積，常用于水體消毒和治療一些魚類的疾病[14-15]。然而使用福爾馬林不合理不僅不能有效控制刺激隱核蟲病還會帶來諸多的副作用，如使用福爾馬林后魚的病程暫時得到控制，但易在7～14 d二次爆發(fā)；福爾馬林會降低水中的溶解氧，導致魚缺氧死亡[16]；Buchmann等[17]研究發(fā)現福爾馬林會抑制虹鱒(Oncorhynchusmykiss)分泌黏液，使其更易遭受水霉和細菌的繼發(fā)性感染；此外，過量使用福爾馬林可能會影響水產品的進出口貿易[18]。因此，在安全有效的殺蟲藥物出現之前，研究如何科學合理的使用福爾馬林，減少其對水生生物的副作用具有重要意義。筆者對刺激隱核蟲和大黃魚幼魚進行不同時間、不同質量濃度福爾馬林的藥浴處理，研究了福爾馬林的毒性作用，并根據刺激隱核蟲生活史規(guī)律，采用不同質量濃度的福爾馬林對感染刺激隱核蟲的大黃魚進行藥浴治療試驗，探討使用福爾馬林的最佳用量和時間，以期為大黃魚室內養(yǎng)殖過程中能夠合理使用福爾馬林防治刺激隱核蟲病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物和刺激隱核蟲

福爾馬林：分析純，37%～40%甲醛(浙江巨化集團公司試劑廠)。

刺激隱核蟲分離于大黃魚，參考文獻[19]的方法，以大黃魚作為動物模型，使用亞致死劑量的幼蟲感染大黃魚3～4 d后，將魚轉移到新的容器中飼養(yǎng)，并將黏附于桶底的刺激隱核蟲包囊收集于燒杯中，在27 ℃滅菌海水中孵化并收集幼蟲進行下一輪感染，建立本試驗蟲株的傳代系統(tǒng)，隨時可以獲得足夠的寄生蟲用于試驗。

1.2 試驗魚與飼養(yǎng)

大黃魚[(3.00±0.78) g，(21.00±2.39) g]購于福建省寧德市三都澳大灣魚排。隨機抽取10尾魚，采集魚的鰓和刮取皮膚黏液進行鏡檢，未發(fā)現刺激隱核蟲。試驗魚在容積為1000 L圓形塑料桶中暫養(yǎng)2周，每日用商品顆粒飼料投喂2次并在投喂前吸除糞便，日投喂量為魚體質量的2%～3%。養(yǎng)殖用水采用沙濾海水，鹽度29～31，溫度 (27±1) ℃，溶解氧≥5.0 mg/L，亞硝酸鹽<0.2 mg/L，微流水飼養(yǎng)，流速為100 L/h。

1.3 幼蟲試驗

根據文獻[19]的方法，略作修改：幼蟲脫包達到高峰期，收集2 h內孵化的蟲液，小心混勻后吸取10份(每份10 μL)蟲液于載玻片，每份加1 μL福爾馬林殺死幼蟲，光學顯微鏡(40×)下計數，計算出幼蟲的密度，用滅菌海水將蟲液密度調成2500 個/mL。

將福爾馬林用滅菌海水配成1000 mg/L，96孔板中加入120 μL滅菌海水，在第1和第2個孔中加入120 μL配好的藥液，從第2個孔等比稀釋至第12孔。然后每孔加入120 μL(約300個幼蟲)蟲液，輕輕地混勻，室溫下孵育，以海水為對照組，于10、30、60、120 min觀察結果，能引起100%幼蟲死亡被認為是最終有效質量濃度。試驗重復3次。

1.4 包囊試驗

收集未分裂包囊，經多次洗滌至干凈無雜質后，挑入24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔約100個。加入不同比例福爾馬林和滅菌海水，使每孔液體總體積為2 mL，同時藥物質量濃度分別為200、150、125、100、75、50 mg/L，以滅菌海水為對照組，每組藥物質量濃度分別處理1、2、4 h后，用滅菌海水多次洗滌徹底除去藥物并加入2 mL新的滅菌海水。置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換1次滅菌海水。試驗開始時置于倒置顯微鏡(40×)下統(tǒng)計每孔包囊數，168 h后統(tǒng)計未孵化包囊數，本試驗重復3次。包囊死亡率按下式計算：

包囊死亡率/%=未孵化的包囊/包囊總數×100%

1.5 急性毒性試驗

預試驗：為確定試驗所需的質量濃度，先選擇較大的質量濃度系列100、200、400、600、800 mg/L進行試驗。每質量濃度放入5尾魚[(3.00±0.78) g ]，不設平行組，試驗持續(xù)96 h，每日記錄各質量濃度組的死亡魚數，并及時取出死魚，統(tǒng)計出24 h 100%死亡的最低質量濃度為600 mg/L和96 h全部存活的最高質量濃度為200 mg/L。

根據預試驗結果，在藥物質量濃度能在24 h內使魚全部死亡的最低質量濃度和96 h魚全部存活最高質量濃度之間，以1.2間隔系數設7個質量濃度梯度，分別是200、240、288、346、415、498、598 mg/L 7個試驗組，以海水為對照組，每組設2個平行組，每平行組10尾大黃魚[(3.00±0.78) g]，水溫(27±1) ℃。記錄24、48、72、96 h內每組魚的死亡數。

半致死質量濃度(LC50)采用Reed-munch方法，分別計算在12、24、48、96 h的半致死質量濃度，即中間忍受限(TLm)：

TLm=C1+P1-(P1-50%)/(P1-P2)×(C2-C1)

式中,C1、C2分別為存活率接近50%的低端質量濃度和高端質量濃度，P1、P2分別為相應的存活率。

安全質量濃度(SC)：

SC=0.3×TLm48/(TLm24/TLm48)2

式中,TLm24、TLm48分別為24、48 h的半致死質量濃度。

1.6 治療試驗

采用2種不同福爾馬林質量濃度治療刺激隱核蟲病，分別為125、75 mg/L，以滅菌海水為對照組。每組設2個重復，每重復組20尾大黃魚 [(21.0±2.39) g]，水溫 (27±1) ℃。試驗前對試驗魚進行人工發(fā)病，按文獻[19]的方法收集孵化2 h內的活躍幼蟲并計算出密度，以3000 個/魚進行人工感染，海水用量為5 L/魚，感染2 h后開啟流水。人工發(fā)病第3 d，每組以對應的福爾馬林治療用量藥浴2 h，之后進行100%換水，恢復微流水飼養(yǎng)，每3 d藥浴1次，共3次。每日記錄每組魚的死亡數，并及時取出死魚，共記錄14 d。

1.7 數據處理

所得數據用SPSS 11.0和Microsoft Excel軟件分析處理，采用單方差因素分析顯著性(P<0.05或P<0.01)。并使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結 果

2.1 幼蟲對福爾馬林的敏感性

試驗結果表明，福爾馬林對刺激隱核蟲幼蟲表現出較強的殺滅作用。在福爾馬林稀釋液中藥浴分別處理10、30、60、120 min，殺死全部幼蟲所需要的福爾馬林質量濃度分別為62.5、62.5、31.3、15.6 mg/L(表1)。

2.2 包囊對福爾馬林的敏感性

結果顯示，包囊存活率與福爾馬林質量濃度、處理時間成負相關。當福爾馬林質量濃度為50～125 mg/L時，隨著福爾馬林質量濃度增加，殺滅作用隨之增強；當福爾馬林質量濃度為125～200 mg/L，處理時間1 h及以上，對包囊的殺滅作用均為100%。50 mg/L的福爾馬林對包囊的存活率具有一定的影響，且包囊存活率隨藥浴處理時間的延長而降低，但處理4 h尚不能殺死全部包囊。

處理1 h可以100%殺滅包囊所需福爾馬林質量濃度為100～125 mg/L，處理2、4 h完全殺滅包囊的福爾馬林質量濃度為50～75 mg/L(表2)。被福爾馬林處理過的包囊不能夠進行分裂，包囊逐漸呈暗黃，內部結構瓦解，而未處理包囊能正常發(fā)育，幼蟲逸出后形成透明空殼(圖1)。

表1 福爾馬林殺滅刺激隱核蟲幼蟲的效果

注：“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”分別代表能引起100%、75%、50%、25%、0%幼蟲死亡.

圖1 福爾馬林處理刺激隱核蟲包囊的顯微鏡觀察(40×)a：未分裂包囊;b:75 mg/L福爾馬林處理2 h包囊168 h的形態(tài);c:未處理的包囊168 h的形態(tài).

%

注：表中代表包囊存活的百分比， *示與對照組差異顯著(P<0.05)；#示與對照組差異極顯著(P<0.01).

2.3 大黃魚幼魚藥物安全性

幼魚對福爾馬林表現出一定的耐受力，結果見表3，隨著福爾馬林質量濃度的增加，大黃魚死亡逐步升高，而較低質量濃度下(≤200 mg/L)不會造成死亡，當福爾馬林質量濃度為240 mg/L時，12 h內出現死亡，死亡率為5%；當質量濃度達到498 mg/L時，大黃魚幼魚12 h內的死亡率達到95%；12、24、48、96 h的半致死質量濃度分別為394.7、365.3、334.4、322.8 mg/L (表4)；計算可知，體質量(3.00±0.78) g的大黃魚安全質量濃度為119.57 mg/L。

表3 大黃魚幼魚對福爾馬林的耐受力 %

注：表中為大黃魚(3.00±0.78) g幼魚在不同福爾馬林質量濃度處理后12、24、48、96 h的死亡率.

表4 福爾馬林對大黃魚幼魚的半致死質量濃度

2.4 治療效果

根據福爾馬林殺滅包囊的質量濃度設置了75、125 mg/L兩個質量濃度梯度，結果見圖1，對照組和75 mg/L組在第6 d開始出現大量死亡，其中對照組在第8 d全部死亡，75 mg/L在第12 d全部死亡，而125 mg/L組的死亡率顯著低于對照組和75 mg/L組(P<0.01)，存活率為87.5%。

圖2 不同處理組大黃魚的死亡率

3 討 論

福爾馬林在生產上，被廣泛用于水體消毒和防治魚類疾病[13]，對魚類體外寄生蟲病的防治效果尤為明顯。在水產上常用的3種藥物中，福爾馬林對多子扇形游仆蟲(Euplotesvannus)和寡毛雙眉蟲(Diophrysoligothrix)的殺滅效果優(yōu)于魯哥氏液、高錳酸鉀[20-21]；Shinn 等[22]研究表明，水體中合理的福爾馬林含量，可有效防控多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)病的爆發(fā)；閆茂倉等[14]研究也發(fā)現，全池潑灑20～80 mg/L的福爾馬林可有效防治刺激隱核蟲病。

由本試驗結果可知，刺激隱核蟲對福爾馬林耐受力較低，當福爾馬林質量濃度為62.5 mg/L藥浴處理 10 min或福爾馬林質量濃度為15.6 mg/L處理2 h均可100%殺死刺激隱核蟲幼蟲；當質量濃度為75 mg/L處理2 h可以完全殺滅包囊。因此，在試驗條件下，使用質量濃度為75 mg/L的福爾馬林，處理2 h可以完全殺滅體外刺激隱核蟲。而利用125、75 mg/L兩種劑量的福爾馬林，每3 d藥浴處理感染刺激隱核蟲的大黃魚的研究結果表明，在實際生產中，質量濃度75 mg/L福爾馬林不能完全殺滅水體中刺激隱核蟲包囊，還會造成刺激隱核蟲對宿主的重復感染；而當藥浴福爾馬林質量濃度達到125 mg/L以上時，可殺滅水體中所有自由生活階段刺激隱核蟲。生產中，利用質量濃度125 mg/L福爾馬林藥浴一次感染刺激隱核蟲的病魚，可滅活自由生活階段的刺激隱核蟲，防止再次對宿主的重復感染從而有效控制刺激隱核蟲病。

刺激隱核蟲病是海水魚類養(yǎng)殖業(yè)危害重大的寄生蟲病[4,6]，易發(fā)生多次重復感染或導致魚類繼發(fā)細菌病，進而造成死亡[26]。滋養(yǎng)體階段的刺激隱核蟲寄生于魚的真皮內，藥物難以殺滅，是其難以治療的主要原因。殺滅水體中自由生活階段的刺激隱核蟲和切斷寄生蟲的傳播途徑是目前預防和治療該病的重要策略，生產中，定期輪換養(yǎng)殖池或通過墊布移除水體中刺激隱核蟲包囊等物理方法或依賴如甲醛、硫酸銅等化學藥物殺蟲可以有效控制刺激隱核蟲病[7,9,27]。但物理方法在實際生產應用中耗時耗力，工人更偏向使用化學藥物。雖然福爾馬林對魚的毒性較低，但生產中大量不合理的使用會導致許多不良后果，如造成病原菌耐性、對魚的毒性、污染環(huán)境、藥物殘留導致的食品安全問題等等。本試驗結果雖然表明一定范圍內的福爾馬林質量濃度對大黃魚無顯著影響，但大黃魚是應激性很強的魚類[5]，大量和長期使用福爾馬林易造成大黃魚自身抗病力下降，導致其他疾病的爆發(fā)[16-18]。因此實際生產上要根據滋養(yǎng)體在魚體的寄生期為3～7 d和包囊從形成到孵化出幼蟲至少需要3 d時間的規(guī)律，每隔3 d用125 mg/L的福爾馬林對魚池進行藥浴處理，處理3次，可有效殺滅水體中的刺激隱核蟲，防止該寄生蟲對大黃魚的重復感染。

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