豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)及注意事項(xiàng)

廖跟東 （廣西田東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 531500）

豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)是檢測(cè)豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體水平的一種方法，是檢驗(yàn)免疫效果的重要依據(jù)。檢測(cè)過程中如果不嚴(yán)格遵守操作規(guī)程檢測(cè)，將對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，現(xiàn)將本人多年來檢測(cè)操作及注意事項(xiàng)歸納如下，供大家參考。

1 樣品準(zhǔn)備

血清稀釋板中，用樣品稀釋液按1∶1比例稀釋待檢血清、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清 （例如∶120μl樣品稀釋液中加120μl待檢血清）。

2 洗滌液準(zhǔn)備

將20倍濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫 （20～25℃），搖動(dòng)使沉淀溶解，然后用蒸餾水或純水作20倍稀釋，混勻 （例如10ml的濃縮洗滌液加上190ml純水）。

3 操作步驟

（1）取抗原包被板加稀釋好的洗滌液200μl，無需靜置，直接甩掉孔中洗滌液，在吸水材料上拍干，重復(fù)洗滌共計(jì)洗板2次 （如用洗板機(jī)洗滌，最后一次拍干）。

（2）將稀釋好的待檢血清、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清各取100μl加入到抗原包被板孔中，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各設(shè)2孔 （輕輕振勻孔中樣品，勿溢出），用封板膜覆蓋包被板，置37℃孵育 2h。

（3）掀棄封板膜，甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μl，無需靜置，直接甩掉孔中洗滌液，在吸水材料上拍干，重復(fù)洗滌共計(jì)洗板5次 （如用洗板機(jī)洗滌，最后一次拍干）。

（4）每孔加酶標(biāo)記物100μl，用封板膜覆蓋包被板，置37℃孵育 30min。

（5）洗滌5次，方法同3.3。

（6）每孔先加底物液 A50μl，再加底物液 B50μl，輕微振動(dòng)反應(yīng)板混勻，室溫 （20～25℃）避光顯色1min。

（7）每孔加終止液50μl，輕微振動(dòng)反應(yīng)板混勻。

（8）設(shè)置酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)為630nm，10min內(nèi)測(cè)定各孔OD630nm值。

4 結(jié)果判定

試驗(yàn)成立條件是陰性對(duì)照的平均OD630nm＞0.5，陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率均＞50%。如果試驗(yàn)不成立有可能是實(shí)驗(yàn)操作失誤造成，再操作一次。S為樣品OD630nm值，N為陰性對(duì)照平均OD630nm值。

阻斷率=（1-S/N）×100%。如果阻斷率≤30%判為陰性，如果阻斷率≥40%判為陽(yáng)性，阻斷率在30～40%，該樣品判為可疑。

5 檢測(cè)中應(yīng)注意事項(xiàng)

（1）在抗原包被板設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照各2孔，每孔的陰、陽(yáng)血清稀釋來源于同一個(gè)稀釋孔稀釋 （即一次稀釋總量為240μl，移液器吹勻后分兩次吸取，每次取100μl加到抗原包被板孔）。

（2）實(shí)驗(yàn)過程使用一次性槍頭移液器標(biāo)準(zhǔn)操作 （吸液時(shí)摁到第一擋位，棄液時(shí)摁到第二擋位），使用多孔道移液器時(shí)，觀察每孔道的吸液量是否一致，如不一致，要壓緊吸頭。

（3）試劑盒保存溫度為2～8C，避免緊貼冰箱壁，造成試劑結(jié)冰。未用完的反應(yīng)板應(yīng)密封保存在密封袋里，2～8℃保存。

（4）所有試劑用前應(yīng)恢復(fù)至室溫 （20～25℃），回溫至少20min。加底物前確保底物液A、B在室溫 （20～25℃），回溫至少30min，且不能將A、B液混合后加入反應(yīng)孔，否則結(jié)果不準(zhǔn)確。

（5）在37℃恒溫箱孵育時(shí)，說明書上沒有對(duì)反應(yīng)板作任何要求的不能對(duì)反應(yīng)板貼膜或加蓋子、濕毛巾等，否則結(jié)果不準(zhǔn)確。

（6）不同批次試劑盒組分不能混用，尤其是反應(yīng)板，對(duì)照及酶標(biāo)抗體，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（7）待檢血清樣品數(shù)量較多時(shí)，應(yīng)先使用血清稀釋板稀釋完所有待檢血清，再將稀釋好的血清轉(zhuǎn)移到抗原包被板上，使反應(yīng)時(shí)間一致。

（8）實(shí)驗(yàn)時(shí)，環(huán)境溫度控制在20～25℃，實(shí)驗(yàn)過程不要將反應(yīng)板直接放在冰冷的臺(tái)面上。否則結(jié)果不準(zhǔn)確。

（9）如出現(xiàn)連續(xù)多次或多人實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)，應(yīng)更換酶標(biāo)儀測(cè)定，驗(yàn)證原酶標(biāo)儀是否可能出現(xiàn)故障。