TREM—1和EGFR在結腸癌組織中表達及意義

王璐 孫小虎 白靜慧 萬義增 陳素賢

【摘要】目的 旨在探討髓系細胞觸發受體（TREM-1）和表皮生長因子受體（EGFR）在結腸癌（CRC）組織及癌旁組織（TAC）中的表達情況及與臨床病理特征的關系。方法 收集手術切除的CRC組織標本68例，采用免疫組化方法及Western blot方法檢測TREM-1及EGFR在CRC組織及TAC組織中的表達情況。結果 TREM-1及EGFR在結腸癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05），且兩者呈正相關性。TREM-1的表達與淋巴結轉移相關，EGFR的表達與浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期相關；差異有統計學意義（P<0.05）。結論 TREM-1和EGFR在結腸癌組織中高表達，高于TAC組織（P<0.05），且二者正相關。提示二者與腫瘤的發展、浸潤及轉移有關。

【關鍵詞】結腸癌；髓系細胞觸發受體-1；表皮生長因子受體

【中圖分類號】R735.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.31..04

Expression and Significance of Trem-1 and EGFR

in Colorecal Carcinoma

WANG Lu1，2，SUN Xiao-hu2，BAI Jing-hui2，WAN Yi-zeng1*，CHEN Su-xian1

（1.Jinzhou Medical University，Liaoning Jinzhou 121001，China；

2.Liaoning Cancer Hospital，Liaoning Shenyang 110042，China）

【Abstract】Objective The main aim of this research is to incestigate the expression and clinical significance of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 （Trem-1） and Epidemal growth factor receptor （EGFR） in colorecal carcinoma （CRC） tissues and tissue adjacent to carcinoma （TAC）.Methods The research collected 68 cases of colorecal tissues from CRC patients as control group. The expressions of Trem-1 and EGFR in colorecal carcinoma tissues and the tissue adjacent to carcinoma were detected by immuno-histochemical and Western blot method.Results Compared with TAC group， the expression of Trem-1 and EGFR were significantly increased in CRC group （P<0.05）.There was a positive correlation between the expression of the two.The expression of TREM-1 were related to lymph node metastasis，and expression of EGFR were possitively correlated to depth of invasion， lymph node metastasis and clinical stages.Conclusion The expression of TREM-1 and EGFR were higher in colorecal carcinoma tissues than in the tissue adjacent to carcinoma，and have positive relations.It suggested that both of EGFR and Trem-1 are related to tumor development， infiltration

and metastasis.

【Key words】Colon cancer；Triggering receptor -1 of myeloid cells；Epidermal growth factor receptor

結腸癌（Colorecal Carcinoma，CRC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有發病率較高、進展迅速等臨床特點[1，2]。尋找新的有效的CRC的治療手段，已經成為目前亟待解決的主要問題。表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種跨膜受體酪氨酸激酶，是原癌基因c-erbB1的表達產物；髓系細胞觸發受體-1（Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）是一種新型調控的炎癥反應因子，主要參與急性炎癥反應。新近的研究發現，TREM-1和EGFR可激活多種下游信號通路，產生多種后續的生物學效應，參與細胞生存、血管形成、腫瘤發生和發展、抗腫瘤免疫、腫瘤化療耐藥性等生理病理活動[3] ，在CRC腫瘤的發生和發展中存在密切的關系。本實驗通過檢測TREM-1和EGFR在結腸癌組織及癌旁組織中的表達情況，分析二者的相關性，進一步探討TREM-1與EGFR的表達與CRC的臨床病理特征的關系，為后續藥物治療提供新的靶點

信息。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標本

選取我院2016年11月～2017年12月在遼寧省腫瘤醫院大腸外科行手術切除并經病理證實為結腸癌的患者68例，選取受試患者病理蠟塊標本及其臨床病理資料作為疾病模型組；同時選取其相應癌旁組織（結腸癌邊緣外≥5 cm）共68例作為對照組。所有病例經核實患者無重復，臨床病理資料完整。

1.1.2 試劑及耗材

兔抗TREM-1抗人單克隆抗體（ab214202）購自英國Abcam公司；兔抗人表皮生長因子（即用型）（GT209307）購自基因科技有限公司；檸檬酸抗原修復液購自：長島抗體診斷試劑有限公司；EDTA抗原修復液購自北京雷根生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器

石蠟切片機（LEICA-RM213）購自德國萊卡公司；臺式水浴恒溫振蕩器（TSHZ-A）購自上海躍進醫療器械廠；全自動化學發光免疫分析儀（SIEMENS Advia Centaur XP）購自德國西門子公司；Olympus光學顯微鏡（H-600）購自日本Olympus公司；德國生物信號顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組和標本處理

本實驗共分CRC模型組及TAC對照組2組。 CRC模型組（CRC組）：選取結腸癌的患者，68例，經患者簽署知情同意書后，受試患者病理蠟塊標本及其臨床病理資料作為模型組。TAC對照組（TAC組）：選取相應癌旁組織（結腸癌邊緣外≥5 cm），68例，作為對照組。

上述標本離體30 min內進行處理，按照分組要求切取面積約1.0 cm×1.0 cm的結腸組織作為受試組織。取出的結腸組織采用生理鹽水漂洗，放入10%甲醛進行固定，標本常規脫水、石蠟包埋，進行SP免疫組化。

1.2.2 SP免疫組化

（1）將組織切片置于梯度酒精中。（2）采用高壓修復。（3）滴加血清封閉非特異性位點。（4）甩掉多余血清，滴加配置好適當比例的一抗。（5）取出切片，PBS沖洗，吸水紙擦掉多余水分，滴加二抗。（6）滴加即用型SABC復合物，置于37℃孵育箱中后PBS沖洗。（7）每張切片分別滴加1滴新鮮配制的DAB液，適時用PBS沖洗終止反應。（8）視蘇木素濃度復染一定時間，以鹽酸酒精分化，自來水下沖洗（返藍）。（9）脫水、透明。

1.2.3 結果判定

在400倍光鏡下，每張組織切片隨機選取10個視野；細胞核及細胞質染色評分：染色面積評估：隨機選取10個視野，計數染色面積測定。0分：無陽性細胞；1分：≤25%；2分：26～50%；3分：51%～100%。染色強度評分：指多數陽性細胞呈現的染色特性：0分：無著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。表達水平通過細胞染色比例及染色強度得分乘積判定。細胞膜評分：0分：無反應或少于10%的細胞膜染色；1分：≥10%的細胞膜出現微弱染色；2分：≥10%的細胞側膜、基底側膜或完全膜出現中度染色；3分：≥10%細胞強染色出現在側膜、基底膜或全部染色；上述分數之和用來判斷Trem-1和EGFR結果，>2分者為陽性，≤2分者為陰性。

1.2.4 Western blot檢測

取5 mg組織加裂解液及蛋白酶抑制劑，對樣品行BCA蛋白測定；制備樣品，制膠后上樣、電泳電壓105 V；采用半干法轉膜，取出含有目標蛋白的膠置于轉膜液中，裁取與膠相匹配的PVDF膜，置于甲醇中約1分鐘，而后置于轉膜液中；接通轉膜儀，取出PVDF膜將其與膠相鄰面朝上置于BSA封閉液中，室溫置于搖床2小時；從封閉液中取出膜，TBST洗膜3次，而后置于配置好比例的一抗中，搖床4℃過夜；次日取出膜，TBST洗3次，室溫置于二抗孵育2小時；二抗反應完畢后TBST洗3次，將ECL試劑盒中A液與

B液混合，置于分析儀中進行圖像采集。

1.3 統計學方法

免疫組化實驗結果采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析，組間計數資料比較時使用x2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。Western Blot結果用Image Quant LAS 4000凝膠成像系統獲得掃描圖像后采用Image J軟件分析灰度值，以P<0.05為差異具有統計學意義的評定標準。

2 結 果

2.1 TREM-1在結腸癌及癌旁組織中表達

免疫組化顯示，在結腸癌組織中，TREM-1陽性定位于細胞核及細胞漿，在癌旁組織中，TREM-1主要表達于細胞膜，兩者的TREM-1陽性表達率分別為69.1%及32.4%。兩者比較；差異有統計學意義（P<0.05）。（見圖1A，1B）。

Western blot實驗結果顯示，結腸癌組織中TREM-1的

灰度值高于癌旁組織中TREM-1的灰度值，分別為0.892±0.039與0.773±0.024，具有顯著性差異；差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.2 EGFR在結腸癌及癌旁組織中表達

EGFR染色結果顯示，在結腸癌組織中，EGFR表達于細胞膜及細胞漿，在癌旁組織中，EGFR表達于細胞膜，兩組的EGFR陽性表達率分別為72.1%及32.4%，兩組間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3A，3B。

Western blot實驗結果顯示，與TAC組相比，CRC組中灰度值水平明顯升高，分別為0.066±0.002與0.042±0.006，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。

2.3 CRC中TREM-1和EGFR的表達與臨床病理特征的關系

TREM-1的表達與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小及TNM分期無相關性；差異無統計學意義（P>0.05）。TREM-1在有、無淋巴結轉移的結腸癌組織中的陽性率分別為82.1%和51.5%，差異有統計學意義（P<0.05）。EGFR的表達與年齡、性別、組織分化程度無相關性，差異有統計學意義（P>0.05），與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期存在相關性；差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 結腸癌組織中EGFR和TREM-1的表達相關性

在CRC組的68例結腸癌組織中，TREM-1和EGFR共同陽性表達例數為36例，共同陰性表達例數為8例，經x2檢驗分析，兩者之間的表達成正相關；差異有統計學意義（r=0.721，P<0.05）。

3 討 論

結腸癌（CRC）是消化系統最為常見的惡性腫瘤之一，具有發展迅速、轉移速度較快、侵襲范圍廣范等臨床特點。目前的主要治療手段為手術治療和放化療的綜合治療。目前，CRC的復發和轉移依然是CRC患者死亡的主要因素[1，4]。然而，目前臨床上CRC的靶向治療尚處于初級階段，因此，充分了解CR發生、發展的生物學特征及其生物靶點是探討CRC的發病機理是防治CRC的重要環節。

本實驗選取的受試CRC疾病模型的患者共68例，其中60歲以上占70%，多數浸潤漿膜層，pTNM分期以II期、III期為主，分化程度以中分化為主。該結果可見，CRC是老年常見疾病之一，并且發病迅速、侵襲范圍廣泛，且淋巴結浸潤也常見。本實驗結果提示，EGFR在CRC中存在過度表達，且與TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度存在相關性。

根據本實驗EGFR的免疫組化染色及Western blot結果顯示，在結腸癌組織中，EGFR主要表達于細胞膜及細胞漿。EGFR是新型的炎癥因子之一，發現其廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞、膠質細胞和角質細胞以及成纖維細胞等表面[5，6]。另外，新近的研究也發現，EGFR的信號通路對多種細胞的生長、增殖和分化等生理及病理過程發揮重要的作用，同時與腫瘤、糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）、免疫缺陷性疾病及心血管疾病也密切相關[7，8]。研究也表明，在結腸、直腸癌中，基因K-ras突變率達到35%-45%，已成為EGFR抗體治療轉移性結直腸癌（Metastatic colorectal cancer，MCRC）的主要療效預測標志物，也開創了MCRC個體化治療的第一步[9]。這提示我們，在CRC的治療中，EGFR可作為CRC患者治療效果的指標和靶點之一，是現今研究的熱點。

本實驗通過免疫組化的方法檢測到，TREM-1在CRC組織主要定位于細胞核及細胞漿中，在CRC中的陽性表達率高于癌旁組織。Western blot實驗結果顯示，與TAC組相比，CRC組中灰度值水平明顯升高。Trem-1是一種炎癥激發的新型受體，有相關研究表明，Trem-1參與了多種炎癥反應的級聯放大過程，某些炎癥成分及炎癥效應可以上調細胞表面的TREM-1的表達[10，11]。TREM-1能協同激活TREM-1的配體，從而引起TREM-1受體向下游傳遞信號，隨后會誘導前炎性因子的產生并引起相關炎癥反應的發生；在新近的研究中提示，TREM-1可能是腫瘤免疫調節的新靶點[12]。該實驗結果提示，TREM-1與CRC的發生、發展相關，可能成為CRC診斷及治療的新作用靶標。

另外，在本實驗結果中也證實，TREM-1和EGFR兩者之間的表達呈現正相關，提示兩者在CRC中存在某種協同作用。同時本次實驗也證實，TREM-1的表達與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小及TNM分期無相關性，與淋巴結是否轉移相關，差異具有統計學意義；EGFR的表達與年齡、性別、組織分化程度無相關性，與浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期存在相關性。

綜上所述，本實驗結果證明了TREM-1和EGFR在CRC組織中的高表達，對結腸癌的的發生、發展起調節作用，為臨床防治CRC提供了重要的理論依據。

參考文獻

[1] Sharma D，Singh G.Clinico-pathological profile of colorectal cancer in first two decades of life：A retrospective analysis from tertiary health center. Indian J Cancer.2017；54（2）：397-400.

[2] Bergerot PG，Hahn AW，Bergerot CD，et al.The Role of Circulating Tumor DNA in Renal Cell Carcinoma. Curr Treat Options Oncol.2018；19（2）：10.

[3] Chung CK，Ge W.Human chorionic gonadotropin （hCG） induces MAPK3/1 phosphorylation in the zebrafish ovarian follicle cells independent of EGF/EGFR pathway.Gen Comp Endocrinol.2013；188：251-7.

[4] Zhong X，Chen B，Yang Z.The Role of Tumor-Associated Macrophages in Colorectal Carcinoma Progression.Cell Physiol Biochem.2018；45（1）：356-365.

[5] Lim SM，Syn NL，Cho BC，et al. Acquired resistance to EGFR targeted therapy in non-small cell lung cancer： Mechanisms and therapeutic strategies.Cancer Treat Rev.2018；65：1-10.

[6] Liu Q，Yu S，Zhao W，et al.EGFR-TKIs resistance via EGFR-independent signaling pathways.Mol Cancer.2018；17（1）：53.

[7] Shi X，Zhang Y，Wang H，et al.Effect of Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 1 （TREM-1） Blockade in Rats with Cecal Ligation and Puncture （CLP）-Induced Sepsis.Med Sci Monit.2017；23：5049-5055.

[8] K?kten T，Gibot S，Lepage P，et al.TREM-1 Inhibition Restores Impaired Autophagy Activity and Reduces Colitis in Mice.J Crohns Colitis.2018；12（2）：230-244.

[9] Subramanian S，Pallati PK，Sharma P，et al.TREM-1 associated macrophage polarization plays a significant role in inducing insulin resistance in obese population.J Transl Med.2017；15（1）：85.

[10] Tammaro A，Derive M，Gibot S，et al.TREM-1 and its potential ligands in non-infectious diseases： from biology to clinical perspectives.Pharmacol Ther.2017；177：81-95.

[11] Feng H，Hu B，Vuori K，et al.EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene.2014；33（19）：2504-12.

[12] Zhou M，Mok MT，Sun H，et al. The anti-diabetic drug exenatide， a glucagon-like peptide-1 receptor agonist，counteracts hepatocarcinogenesis through cAMP-PKA-EGFR-STAT3 axis.Oncogene.2017；36（29）：4135-4149.

本文編輯：趙小龍