煙草葉片在二氯喹啉酸脅迫下的蛋白組學分析

張 純，馮 莉，張泰劼，田興山

（廣東省農業科學院植物保護研究所，廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640）

煙草（Nicotiana tabacum）是我國重要的經濟作物，在湖南、廣西、廣東等南方煙區，煙草種植主要實行“水稻-煙草”輪作或隔年輪作模式，該模式能充分均衡土壤養分，提高施肥效益，消除土壤有毒物質，減少病蟲害，提高煙葉質量。

二氯喹啉酸（3，7-二氯-8-喹啉羧酸，Quinclorac）屬生長素類除草劑，在我國水稻種植區廣泛使用，是防治稻田稗屬雜草（Echinochloa spp.）的特效除草劑，具有藥效好、價格低廉、對稗草特效等優點，深受廣大農戶歡迎，但該藥同時也是殘留期較長的除草劑，在土壤和水中不易降解[1-2]。在稻-煙輪作區，長期或盲目使用后，土壤中殘留的二氯喹啉酸會對煙草產生明顯藥害，煙草通常畸形生長，表現為新葉葉緣下卷，葉片皺縮，狹窄細長，嚴重影響煙葉的產量和質量[3-4]，給煙農帶來嚴重的經濟損失。殘留藥害具有很大的危害性和隱蔽性，通常觀察到藥害癥狀時，作物已經出苗甚至到了種植后期，造成的損失難以挽回[2]。為了減輕二氯喹啉酸殘留對后茬作物的影響，有許多研究致力于二氯喹啉酸導致作物尤其是煙草葉片畸形的解毒劑篩選工作。研究表明，一種從農藥廠土壤中分離的細菌（Burkholderia cepaciaWZ1）可以有效降解土壤中的二氯喹啉酸[5]。TiO2作用的光催化反應可以有效降解水中的二氯喹啉酸[6]。此外，硝普鈉、CaCl2、蕓苔素內酯等藥劑對二氯喹啉酸致畸的煙葉有一定的解毒效果，淡紫擬青霉菌劑和碳酸鉀對低殘留二氯喹啉酸引起的煙草畸形有很好的緩解作用，但解毒時間較長，短期效果不明顯[7]。

二氯喹啉酸作用機理之一是模擬過量生長素的作用，激活植物體內9-順式環氧類胡蘿素雙氧合酶（NCED）基因催化合成ABA，促進活性氧的產生，促進氣孔關閉和抑制細胞生長和分裂[8-10]，其除草對象主要為單子葉植物，相關作用機理研究主要圍繞靶標植物稗草展開[11]，而殘留藥害對煙草生長影響的研究較少。本研究首次利用iTRAQ技術分析二氯喹啉酸導致煙草畸形生長后的煙草葉片蛋白表達變化，篩選出差異基因，并分析了其中具有顯著表達差異的蛋白ABA2[參與脫落酸（ABA）合成]和NCED（ABA合成的關鍵催化酶）的基因受二氯喹啉酸誘導的表達模式，初步探究了煙草抵抗二氯喹啉酸脅迫的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙草種子由廣東省農業科學院植物保護研究所雜草研究室保存，溫室播種，育苗，于3～4片真葉期移栽。用于蛋白組學研究的材料于煙草五葉一心期用0.67 mg/mL濃度的二氯喹啉酸（50%二氯喹啉酸可濕性粉劑）處理7 d后取材。用于熒光定量PCR驗證試驗的煙草材料于二氯喹啉酸處理后0、6、12、24、48、72 h及7 d取材。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品總蛋白提取和濃度檢測 采用三氯乙酸（Trichloroaceti Acid，TCA）/丙酮法提取煙草葉片蛋白質[12]，取煙葉組織液氮研磨，加入TCA/丙酮抽提，–20℃靜置30 min，5000×g，4℃離心30 min，棄上清，加入適量–20℃預冷丙酮洗2次，干燥后，加入蛋白抽提液和Tri-飽和酚振蕩30 min，5000×g，30 min，4℃離心，棄上清，重復1次。加入5倍體積0.1 mol/L乙酸銨/甲醇，–20℃過夜，次日5000×g，4℃離心30 min，棄上清；加2倍體積的甲醇洗2次，加丙酮洗2次，離心，4℃干燥。尿素裂解液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.2 mol/L TEAB）溶解蛋白樣品粉，用Bradford法[13]進行蛋白質定量。

1.2.2 蛋白樣品酶解與標記 準備含量100 μg的蛋白樣品溶液稀釋到總體積20 μL。加入0.2 mol/L TCEP使蛋白還原，56℃反應1 h。加入375 mmol/L新鮮配制IAA使烷基化，避光反應1 h。樣品液中加入5倍體積丙酮，–20℃沉淀過夜。加入0.2 mol/L三乙基碳酸氫銨（Triethylammonium bicarbonate）復溶蛋白樣品。按胰蛋白酶和樣品1∶50的比例，加入胰蛋白酶，37℃反應過夜，pH試紙測定樣品溶液的pH（7～9）。

取出酶解后樣品加入55 μL無水乙腈振蕩溶解5 min，微離心。取50 μL標記試劑加入到蛋白樣品酶切后溶液中，室溫反應1 h。加入8 μL 5%羥胺（Hydroxylamine），15 min，終止標記反應。每組標記的樣品各取1 μg混合，干燥。經C18柱SPE去除鹽離子后，肽段樣品用流動相A[200 mM甲酸胺（pH 10）]復溶，離心吸取上清液。在Thermo RSLC 3000上，收集通過waters的Xterra Ms C18柱（3.5μm，2.1 mm×150 mm）的第12～60分鐘的樣品餾分（液相流速為0.2 mL/min），準備96孔板，一次標記，用于收集分離得到的組份1～48。將48個組份合并成12部分。樣品溶液干燥。

1.2.3 基于orbitrap fusion的LC-ESI-MSMS分析用含2%CAN、0.5%甲酸的水溶液，溶解蛋白肽段干粉，離心取上清液。對每個組份進行獨立的質譜檢測，基本條件如下：高效液相色譜儀，Thermo Scientific RSLC Nano 3000；富集柱，Thermo PepMap u-precolumn（5μm，300μm×5 mm）；分析柱，PepMap C18 反相納升柱（3 μm，75 μm×150 mm，Dionex）；主要有機相梯度135 min 4%～90%ACN in 0.1%FA；流速300 nL/min；上樣量1μg；質譜儀Thermo Orbitrap Fusion；噴霧電壓1.9 kV；離子傳輸管溫度275℃；掃描模式正離子；碰撞能量40%HCD；分辨率設置，一級（m/z 200），二級（m/z 200）；母離子掃描范圍 m/z 350～1550；子離子掃描范圍，自動。

1.2.4 蛋白質的鑒定和定量 所獲得的肽段數據經轉換軟件Proteome Discoverer1.4轉換成mgf格式后，通過Mascot 2.5.1程序進行蛋白質檢索。選擇UniProt中的茄科數據庫進行肽段匹配和蛋白質定性鑒定分析，搜庫參數設定為（1）酶解：Trypsin；（2）最大漏切位點數：1；（3）固定修飾：Carbamidomethyl(C)， TMT6plex(N-term)，TMT6plex(K)；（4）建好的數據庫命名為Uniprot_Solanaceae。試驗組樣本和對照組樣本相比，差異倍數大于1.5倍的蛋白，結果經雙尾t檢驗，p＜0.05的蛋白視為顯著差異表達蛋白。

1.2.5 差異蛋白的驗證 五葉一心期煙草經二氯喹啉酸處理后6、12、24、48、72 h和7 d取材，取幼嫩葉片利用Trizol-reagent提取總RNA，每1.5 μg RNA樣品用2個單位的DNase I處理以除去基因組DNA，再利用Reverse Transcriptase MMLV（TaKaRa BIO Inc.,Otsu,Japan）試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。利用Real-time PCR技術在基因水平上檢測差異蛋白對二氯喹啉酸的響應。SYBR Premix Dimer Eraser TM試劑盒（TaKaRa BIO Inc.,Otsu,Japan）進行Real-time PCR反應，PCR反應體系：10 μL Premix Dimer Eraser TM（2x），上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），模板 2 μL，總體積 20 μL。利用BioRAD熒光定量PCR儀器進行PCR擴增，反應條件：95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環。基因相對表達量利用2-ΔCt方法計算。基因擴增引物如表1所示。

2 結果

2.1 iTRAQ試劑標記煙草葉片組織的蛋白質表達

二氯喹啉酸對煙草葉片尤其是嫩葉片的生長有明顯的抑制作用，二氯喹啉酸處理后新長出來的葉片均表現為畸形（圖1），煙草葉片長度和寬度與正常煙草葉片相比存在顯著差異（表2）。利用iTRAQ和生物信息學技術，分析二氯喹啉酸和清水處理后的煙草葉片蛋白表達情況，結果顯示，從二氯喹啉酸處理后的煙草畸形葉片中共鑒定到3255個蛋白，正常煙草葉片鑒定到3308個蛋白。通過比較二氯喹啉酸處理后的畸形煙葉和正常煙葉中蛋白相對表達豐度，共鑒定出65個差異蛋白，上調蛋白23個，其中10個蛋白功能未知，下調蛋白42個，其中7個蛋白功能未知，差異蛋白分子量介于5～102 kDa之間（表3）。與正常煙葉相比，畸形煙葉中參與光合作用、碳固定、氮代謝等代謝途徑的蛋白酶下調表達，而與免疫反應相關的谷胱甘肽代謝途徑蛋白表達量增加（表3）。

表1 試驗所用到的引物Table 1 Primers used in the study

圖1 煙草表型特征（N：清水處理后的正常煙草葉片；M：二氯喹啉酸處理后20 d煙草葉片特征）Fig.1 Phenotypes of tabacco leaves 20 d after treatment with H2O and quinclorac.（N and M indicate Normal and Malformed leaves which resulted by H2O and quinclorac residues respectively.）

對差異蛋白進行GO聚類分析顯示，在生物過程方面，差異蛋白主要參與光合作用、細胞代謝及免疫反應過程等。細胞組分聚類分析顯示，差異蛋白主要為細胞膜蛋白、大分子復合物以及細胞器蛋白，行使結合、催化和轉運等分子功能（圖2）。此外，差異蛋白共參與27種KEGG代謝途徑，其中有9條KEGG代謝途徑是顯著的，包括代謝途徑（26%）、碳代謝（15%）、光合作用中的碳固定（13%），二羧酸代謝（12%）、氮代謝（5.75%）和谷胱甘肽代謝途徑等（圖3）。

表2 二氯喹啉酸處理后煙草葉片形態參數變化Table 2 The change of leaf morphological parameters of cefazolin acid treatment after quinclorac.

表3 二氯喹啉酸處理后煙草葉片差異表達蛋白Table 3 The main differentially accumulated protein species between normal and malformed tobacco leaves.

圖2 畸形煙草葉片較正常煙草葉片差異表達蛋白聚類分析（Biological process，生物過程；Molecular function，分子功能；Cell component，細胞組分）Fig.2 Gene Ontology(GO)analysis of the differential expression protein in normal and malformed tobacco leaves.GO analysis was performed at level 2 for the three main categories.

圖3 KEGG通路分析Fig.3 Analysis of KEGG Pathways

2.2 二氯喹啉酸誘導差異蛋白基因的表達

為了驗證蛋白數據的可靠性，挑選了11個差異蛋白基因，采用熒光定量PCR方法分析其在二氯喹啉酸處理7 d后的煙草葉片中表達變化，包括2個上調基因（谷胱甘肽s-轉移酶和過氧化氫酶）和9個下調基因（核酮糖-1,5-二磷酸羧化加氧酶（Rubisco）、葉綠體PsbQ1蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶B、葉綠素a/b結合蛋白、萌發素蛋白、磷酸甘油酸激酶、硝酸還原酶、ABA2）。結果顯示，所有挑選的基因表達變化趨勢與蛋白組學結果一致，表達上調的2個基因上調倍數為17.5和1.8，表達下調的基因表達差異倍數在0.02～0.76之間，符合大于1.2（上調）或者小于0.8（下調）蛋白差異篩選標準（表4）。

二氯喹啉酸作為生長素類除草劑，其作用機理之一是模擬過量生長素的作用，激活植物體內9-順式環氧類胡蘿素雙氧合酶（NCED）基因催化ABA的合成，ABA促進衰老，促進活性氧的產生，促進氣孔關閉和抑制細胞生長和分裂[8-10]。本研究的蛋白組學實驗結果顯示，二氯喹啉酸處理后的畸形煙草葉片中脫落酸ABA合成途徑中ABA2蛋白比正常葉片中含量低，因此進一步檢測了ABA2基因及ABA合成關鍵酶基因NCED在二氯喹啉酸處理后0～72 h的表達情況，結果顯示在二氯喹啉酸處理后12 h，NCED的表達量開始上調表達，到24 h達到表達高峰，而ABA2則在處理后24 h上調，48 h才達到表達高峰。處理后72 h，NCED和ABA2的表達量都降到較低水平（圖4）。

表4 熒光定量PCR（qRT-PCR）分析驗證部分差異蛋白表達Table 4 qRT-PCR analysis of some of the gene expression which encode the differentially accumulated proteins

圖4 二氯喹啉酸誘導煙草NCED和ABA2基因表達Fig.4 Expressions of mRNA of NCED and ABA2 gene in tobacco leaf treated with quinclorac

3 討論

二氯喹啉酸的除草對象主要為單子葉植物稗草，相關作用機理已有較多研究[11]，而殘留藥害對作物生長的影響研究較少。在我國稻-煙輪作區，二氯喹啉酸殘留藥害問題嚴重，市場上尚缺乏有效針對二氯喹啉酸藥害的解毒劑或抗逆煙草品種。本研究運用iTRAQ蛋白組學技術比較了二氯喹啉酸處理后的煙草葉片與正常煙草葉片之間的蛋白質差異，篩選出65個差異蛋白，主要參與光合作用、防御免疫等生物學過程，在細胞質、細胞器和細胞膜上，主要行使結合、催化等分子功能。本文就光合作用、免疫反應系統、ABA合成通路中差異倍數較大的蛋白進行分析。

3.1 光合作用相關差異蛋白表達分析

生長素類除草劑能顯著影響光合作用中的各種生理反應，如氣孔的關閉、碳固定的減弱等[8]。有研究表明，二氯喹啉酸顯著影響稗草光合系統各相關蛋白表達，破壞植株光合作用[11]。本研究發現，二氯喹啉酸藥害導致煙草葉片畸形，從畸形葉片中鑒定出的65種差異蛋白中有24種參與了光合作用，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化加氧酶（RuBisco）、葉綠體PsbQ1蛋白、捕光葉綠素a/b蛋白和33 kDa光系統Ⅱ中放氧復合物表達差異顯著。Rubisco蛋白約占植物可溶蛋白的50%，是光合作用中的關鍵酶，調節光合和光呼吸，鮮有其他分子功能報道[14]。PsbQ1蛋白是組成光系統II的重要外周蛋白之一，對維持光系統II的放氧活力起重要作用。最近的研究表明PsbQ蛋白在維持PSⅡ的結構完整性、增強PSⅡ對環境適應性方面發揮重要作用[15]，并參與一些抗逆脅迫應答反應[16]。捕光葉綠素a/b結合蛋白主要行使光能的吸收和傳遞功能[17]，對植物適應各種環境脅迫的過程中起著重要作用。33 kDa光系統Ⅱ中放氧復合物對PSII的放氧活力維持起重要的作用，同時保護錳簇不被還原劑等化學物質進攻[18]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）是細胞內的一個組成型表達的蛋白質，是碳固定代謝途徑中的關鍵酶，其β亞基是維持鹽脅迫下光合作用和植物生長發育過程的重要因子[19]。綜合來看，這些差異蛋白雖是光合作用系統中關鍵酶，同時還具有響應外界脅迫等功能，因此，在二氯喹啉酸殘留藥害影響下，光合作用系統中這些蛋白的表達變化顯著。

3.2 免疫反應相關差異蛋白表達分析

煙草對環境脅迫較為敏感，為了適應各種環境因子的變化，在外界環境因子改變時，煙草會在形態上和生理生化代謝方面進行一系列調整，而蛋白質直接參與并調控植物對環境脅迫的適應性反應。蛋白組學分析結果顯示二氯喹啉酸處理煙草后，鑒定出植物萌發素、過氧化氫酶和谷胱甘肽S-轉移酶等響應外界脅迫的蛋白。植物類萌發素蛋白（GLPs）是其中一類重要的脅迫響應蛋白，具有多種生物學功能，在植物的生長發育階段、生物和非生物逆境脅迫應答中起重要的作用[20-21]，在本研究中，二氯喹啉酸處理后，GLPs表達量下降，推測該酶可能并不參與煙草對二氯喹啉酸的脅迫響應。谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)是一類催化還原型谷胱甘肽(GSH)與各種親電化合物的親核加成反應酶，在生物和非生物脅迫中具有重要作用，許多參與植物抗逆/抗病響應的GST被分離鑒定，包括水稻的 OsGST2顯著響應稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的誘導[22]，小麥對白粉病（Erysiphe graminis）的抗性[23]，番茄對鹽脅迫的響應等[24]，本研究發現兩個煙草GSTs蛋白表達顯著上調，推測這兩個GSTs蛋白在煙草抵抗二氯喹啉酸的脅迫中起重要作用。

3.3 脫落酸、過氧化氫酶對二氯喹啉酸的響應

脫落酸（ABA）是一種能引起芽休眠、葉子脫落等生理作用的植物激素。在逆境條件下，植物體內的ABA通過促進氣孔關閉，降低葉片伸展率等方式增強植物的抗逆性[25]。生長類除草劑作用機理之一是模擬過量生長素的作用，激活植物體內9-順式環氧類胡蘿素雙氧合酶（NCED）基因，催化ABA的合成[26]。過氧化氫（H2O2）和ABA都能夠誘導氣孔關閉，并且ABA誘導氣孔的關閉依賴于H2O2的生成[27]。本研究蛋白組學結果顯示，二氯喹啉酸處理后煙草中H2O2的含量顯著上升，但ABA合成通路中的ABA2基因表達量下降。檢測ABA2及ABA合成催化酶NCED基因在二氯喹啉酸處理后0～72 h的表達水平，結果顯示處理12 h后NCED的表達量開始上調，24 h達到表達高峰，48 h后開始下降，而ABA2基因表達高峰比NCED晚12 h，72 h后下降至較低水平，因此在二氯喹啉酸處理7 d后的煙草畸形葉片中未檢測到ABA2蛋白上調。二氯喹啉酸處理前期誘導煙草ABA2和NCED基因表達上調，ABA和H2O2的大量合成會導致煙草葉片氣孔關閉和葉片伸展率降低，這可能是煙草葉片光合作用相關蛋白表達量顯著下調，同時導致煙草葉片畸形生長的主要原因。

4 結論

通過分析比較二氯喹啉酸處理后煙草葉片和正常煙草葉片之間蛋白組表達差異，初步明確了二氯喹啉酸能導致煙草光合作用系統、ABA合成通路、碳代謝等途徑部分蛋白非正常表達，從而對煙草生長發育造成嚴重影響。根據脫落酸ABA合成通路中的ABA2及NCED基因受二氯喹啉酸誘導表達模式，推測煙草植株內存在一種應激反應機制，抵抗二氯喹啉酸脅迫，研究結果可為二氯喹啉酸藥害機理研究及補救方法的制定提供理論依據。

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