CircRNA與骨相關疾病

翟乃祥 任秀智 魯艷芹 韓金祥*

1. 山東省醫藥生物技術研究中心，山東省醫學科學院，山東 濟南 250062 2. 濟南大學-山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南 250200 3. 天津市武清區人民醫院，天津 301700

遺傳性骨病是臨床上表現出具有較強遺傳異質性的骨、軟骨發育不良的疾病，以骨骼塑形、生長、分化、內部穩態等異常為特征，多為發病率較低的罕見病，遺傳性骨病患者是龐大的群體。近年來不斷有研究發現circRNAs在疾病調控中的作用，本文就circRNAs對骨相關影響的研究進行總結。

1 CircRNA及其特點

1.1 CircRNA分類

CircRNA是一類特殊的非編碼RNA(Noncoding RNA)它的特殊性在于它并不是傳統的5‘到3’的線性結構，而是長度在幾百個堿基以上的閉合的環型結構[1]。在馬鈴薯中的RNA病毒、酵母菌[2]中發現circRNAs的時候認為它們是無意義的編碼副產物[3]，但從小鼠精子決定基因中發現circRNAs可以進行轉錄后[4]，對circRNAs的研究便開始了新的時代，circRNAs的研究逐漸深入，其功能、特點、結構、形成方式等開始為人們所知。

根據形成方式的不同，內源性circRNAs可分為內含子circRNAs、外顯子circRNAs和外顯子-內含子circRNAs[5]。

1.1.1內含子形成的circRNA:內含子形成的circRNA通常是RNA 聚合酶將內含子從mRNA前體上剪切下來，內含子首尾相接成環形，這種circRNAs被稱為環狀內含子RNA(ciRNA)。ciRNAs主要存在于人類細胞。它的合成需要一個重要的位點:包含一個接近5′端，長度為7 nt 富含堿基G、U的拼接位點和RNA剪切分支位點附近11個nt的堿基C富集區域[6]。

1.1.2外顯子形成的circRNA：外顯子circRNA是目前研究最多的circRNAs，它們中一部分衍生自編碼RNA的5‘或3’非翻譯區(5‘UTR或3’UTR)，其他來自非編碼RNA[7-8]。外顯子circRNAs的形成有兩種假說，第一種假說認為前體RNA在轉錄時越過了一段外顯子，之后剪切酶在這段被越過的外顯子兩端進行切割，切割后的兩端相連形成閉合的鎖套結構(lariat)[9]。通過剪接會產生多種circRNAs: circRNAs可通過背接法(Back-Splicing)從單一的外顯子衍生出來，也可由多個外顯子經外拼接形成circRNAs。另一種假說認為RNA轉錄時外顯子兩端的內含子發生了堿基配對，由下游的外顯子3′端尾巴連接到上游外顯子5′端頭部，下游3′剪接體結合上游5′剪接受體，使兩個內含子結合，而環化的外顯子被釋放成為了circRNAs[10]。

1.1.3外顯子和內含子片段組成的circRNA：許多細胞核內的circRNAs包含未剪接的內含子，這些circRNAs被稱為外顯子-內含子circRNAs(EIciRNA)[11]。EIciRNA大量存在于轉錄位點，如果去除EIciRNA則會降低親本mRNA的表達，表明這些circRNAs可以促進親本mRNA轉錄[12]。如EIciRNA可以與U1snRNP(U1核內核糖核蛋白)結合促進RNA 聚合酶 II與啟動子相互作用從而增強基因轉錄[13]。

1.2 CircRNA特點

CircRNA具有穩定性高、分布廣、進化相對保守、表達的時序性與特異性等特點。CircRNA不同于一般的線性RNA，是不含有poly A尾巴的5′、3′端閉合環狀結構，沒有核酸外切酶的切割位點，因而不易被酶切降解，這種結構穩定性使其在面對環境變化時對內環境穩態發揮重要作用。CircRNA在真核、原核生物[14]、類病毒、病毒、以及古生菌[15]中廣泛存在。與其線性異構體[16]相比，circRNA的表達水平會高出10倍甚至更多。大部分circRNA存在于真核生物的細胞漿中，少數位于細胞核內[17]。CircRNA在進化上相對保守[18]，在不同物種中往往存在較多相似序列，從人腦中檢出的circRNAs在小鼠、果蠅中都有相似序列，比如在小鼠體內發現的1 903個circRNA有81個在人類體內也存在相同的拷貝。比較豬、人和小鼠的circRNA序列發現20.20%的豬circRNAs具有人類直系同源物，而16.96%的豬circRNAs具有小鼠直系同源物。豬的circRNAs有29.4%在人體內有直系同源外顯子[19]。在小鼠和人體內分別有1,510個circRNAs(25.45%)和5,189個circRNAs(87.44%)與家豬circRNAs有直系同源物。

CircRNAs在動物不同時期、不同組織的表達水平不同，具有發育階段和組織特異性:在果蠅大腦中，有些circRNAs會隨著年齡而增多。在線蟲體內的上千種circRNAs中，不同時期的circRNAs表達數目和具體種類不同。血液中circRNAs的表達量高于肝臟和小腦，大部分血漿中的circRNAs存在于有膜脂包被的結構[20]，如外泌體和微小囊泡[21]。

2 CircRNA生物學功能

2.1 MiRNA分子海綿

許多circRNAs上有miRNAs結合位點，使其成為競爭性內源RNA，可以與miRNAs結合從而將miRNAs隔離。例如：miR-652-3p可以以結合編碼基因的方式發揮作用調節線粒體功能，miR-652-3p靶向作用于MTP18，與其3'UTR序列互補結合。沉默其表達，對線粒體增殖和凋亡起到調控作用。而circRNA-MFACR通過結合miR-652-3p，促進MTP18mRNA翻譯表達，調控心肌細胞中線粒體分裂和凋亡。即circRNA可以作為內源性“miRNA分子海綿”與miRNAs吸附在一起，使其喪失正常功能。“miRNA分子海綿”抑制miRNAs與靶基因結合的功能可以在不同基因組中表達，參與調節細胞miRNAs豐富度，是miRNAs介導的轉錄后調節網絡的主要組分[22]。

2.2 編碼蛋白/多肽功能

與傳統認識的非編碼RNA不同，部分circRNAs具有蛋白質或多肽編碼功能， circ-ZNF609能夠編碼肌肉分化相關蛋白，該circRNAs從其宿主基因的第二外顯子成環處生成，帶有一個753nt的開放閱讀框架(ORF)，它的UTR元件能驅動不依靠5'端帽子，而依靠IRES序列的順式調控原件從circRNAs的中部啟動并進行蛋白質翻譯，但這種翻譯速度要低于帽子端起始的正常翻譯[23]。還有circRNAs可以在m6A甲基化修飾后驅動非帽子依賴性的翻譯。與IRES序列相似，m6A甲基化區也能驅動circRNAs翻譯，它可以識別YTHDF3蛋白，結合到circRNAs的修飾位點并吸引eIF4G2蛋白和其他翻譯起始因子來驅動circRNAs的翻譯[24]。m6A修飾的circRNAs還有高度的細胞特異性，即使是相同的circRNAs分子在不同的細胞中m6A修飾的狀態也不盡相同。m6A一般傾向修飾大片段外顯子circRNA。有一些circRNAs會與核糖體結合形成Ribo-circRNA復合物來影響編碼，它們的UTR區有類似IRES的翻譯驅動功能，但翻譯效率較低[25]。CircRNAs的蛋白翻譯功能的影響意義是巨大的，如circ-FBXW7可直接翻譯蛋白FBXW7-185aa，與其母基因編碼的FBXW7蛋白協同調控c-Myc的穩定性，抑制惡性膠質瘤的生長[26]。這種發現為circRNAs并非一般的非編碼RNA提供了證據。

2.3 參與轉錄調控及表達

CircRNAs可以與蛋白質結合，或通過影響RNA剪接而與蛋白質發生關聯，間接影響蛋白質的功能，起到調節轉錄或剪接的作用。外源性circRNAs通過內部的核糖體進入位點(IRES)或通過滾環擴增機制在體內或體外進行翻譯[27]。植物體內circRNAs能在轉錄中參與R-Loop結構形成，拖慢轉錄的進行來影響RNA與RNA和DNA與RNA相互作用來實現調節基因表達，促進可變剪切的產生。在基因表達方面，circRNAs發揮類似mRNA的作用，通過與翻譯起始位點結合或破壞成熟的線性RNA的完整性使線性轉錄物不翻譯，EiciRNAs與RNA 聚合酶相互作用后與小核糖核蛋白結合，進而激活親代基因的轉錄，抑制RNA-蛋白質相互作用并調節miRNAs的活性[28]。

2.4 CircRNA生物標志物與信號通路調節

細胞內的circRNAs會被分泌到細胞外泌體，由于circRNAs穩定且不易降解的特性，它在外泌體和血漿中的存在相當穩定且廣泛。這為其作為疾病標志物奠定了基礎。血液中的總circRNAs表達水平與神經組織十分相似，如：circRNA cdr1在阿爾茨海默病人血液中特異性表達[29]，與正常人相比直腸癌患者血液中就多出257種新circRNAs。而且與正常血清相比，這些癌癥血清中circRNA-KLDHC10的表達水平明顯升高[30]。MHCC-LM3型肝癌細胞中circRNAs與線性RNA的比例是普通細胞中的7倍[30]。可以說外泌體和血漿中穩定存在的circRNAs為診斷某些癌癥提供了便利途徑，circRNAs可作為一種可靠的疾病標志物發揮功能。

由于circRNAs不易被核酸酶降解的特性，可以在體外通過核酸酶處理去除線性RNA，得到高純度的外源circRNAs之后用外源circRNAs轉染發現細胞的自身免疫效應通路被激活，起到抑制病毒感染的作用，表明外源circRNAs在機體免疫等信號通路調節可能存在重要作用[31]。

3 CircRNA與骨相關疾病

3.1 CircRNA與骨關節疾病

關節炎(Osteoarthritis, OA)是一種由于軟骨降解，骨質增厚，骨刺形成而引起的退行性關節病[32]。研究者通過circRNAs芯片對OA病人和正常人進行circRNAs差異表達篩選和ceRNAs網絡共表達分析，在關節炎與正常軟骨中，有71種circRNA、表達存在差異，circRNA_100876(circRNA-CER)、circRNA_100086、circRNA_101178和circRNA_101914等16個circRNA表達上調，另外55個表達下調，它們在軟骨損傷和關節炎病情發展中可能有重要作用。其中，circRNA-CER可以被細胞白介素1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNFa)誘導表達上調，它通過內源性競爭miR-136來調控MMP13的表達，參與軟骨細胞細胞外基質損傷過程。TNFa可以促進miR-193b的表達，miR-293b可以抑制早期軟骨形成，而它調節早期軟骨形成的靶基因IGF1R又可以被circRNA_0045714促進表達，由于基因IGF1R在早期軟骨形成中的重要作用，circRNA_0045714在與關節炎疾病中也可能存在重要作用[33]。

3.2 CircRNA與成骨細胞和破骨細胞

成骨細胞和破骨細胞是骨形成的主要功能細胞，成骨細胞的分化由一系列激素、細胞因子和轉錄因子調控[16]，其中轉錄因子中的骨形成蛋白2(BMP2)屬于轉化生長因子β(TGF-β)超家族，是人體重要的細胞因子之一，也是異位骨和軟骨形成的誘導劑[32]，在胚胎成長、細胞生長和分化及骨骼發育和骨折修復中起重要作用。經過BMP2處理的MC3T3-E1細胞中有158個circRNAs與正常細胞相比有表達差異，其中74種circRNAs上調，84種circRNA下調。通過qRT-PCR檢驗了4種circRNAs的表達情況，發現經過BMP2處理后，細胞中circRNA5846，circRNA19142和circRNA10042都顯著上調。CircRNA5846和circRNA19 142分別與51種和21種miRNA有相互作用, 它們均與MiR-7067-5p作用行使miRNA海綿功能，且與FGF，EGF，PDGF和Wnt信號通路相關，可以參與細胞生長和分化[34]。BMP2可通過circ19142 / circ5846靶向miRNA-mRNA調節網絡誘導成骨分化[34]。經BMP2處理組成骨分化相關因子ALP、SP7和RUNX2的mRNA表達水平顯著增加。另外，CircRNA19142與miR-222-3p和miR-7067-5p相互作用[35]，而miR-222-3p能作為破骨細胞發生的抑制劑[26]。CircRNAs在小鼠破骨細胞生長的不同階段也是不同的，在檢測的1 797種circRNAs中，147種circRNA在前破骨細胞表達上調，109種表達下調；在成熟破骨細胞中，78種circRNA表達上調；在活化的破骨細胞中，111種circRNA和94種miRNAs表達上調[36]。

3.3 circRNA與其它非編碼RNA與靶基因的作用

CircRNA-miRNA協同調節在破骨細胞形成過程中發揮重要作用。在協同調節網絡中的miR-103受circRNA007873的上調和circRNA010763、circRNA015622的下調。Wnt1在骨、軟骨發育中發揮重要作用，Wnt1是XV型(osteogenesis imperfect，OI)常染色體隱性遺傳成骨不全的致病基因。目前已知的靶向Wnt1的miRNAs包括let-7e、miR-21、miR-34 a、miR-122、miR-148 a、miR-148b與miR-152等7種。針對以上miRNAs分析中與之相互作用的circRNAs、靶基因的生物信息學研究表明，這些miRNAs及其靶基因聚集在Focal adhesion、MAPK、Notch與TGF-beta信號通路， MAPK信號通路中發現DUSP1與MRPS35_hsa_circ_001042 均分別是與miR-21、miR-148 a、miR-148b及miR-152等4種miRNAs相互作用的靶基因與circRNA。ARHGAP35_hsa_circ_001101、KIAA0922_hsa_circ_001421與 PARP16_hsa_circ_000601與miR-34 a、miR-148 a、miR-148b和miR-1524等4種microRNAs分子相互作用，可能發揮分子海綿功能(Ref73)[37]。

4 總結與展望

綜上所述，circRNA結構穩定，功能復雜，來源多樣，分布廣泛，未來關于其蛋白編碼功能以及“miRNA分子海綿”功能仍有待進一步研究，目前對于circRNA與骨相關疾病的研究成果較少，但miRNAs與骨病已經有大量經過驗證的功能，例如與成骨細胞相關的miR-222-3p和miR-7067-5p會被circRNA5846和circRNA19142調控。鑒于circRNAs與miRNAs之間可能存在的豐富的相互作用，circRNAs很可能通過與miRNAs的相互作用或是自身的編碼能力對遺傳性骨病產生影響。故對circRNAs的研究對骨相關病的成因以及基因層面的治療都意義重大。