miRNA在絕經后骨質疏松癥腎陰虛證中的表達譜特征及生物信息學分析

謝麗華 陳娟 謝冰穎 許惠娟 陳賽楠 葉云金 葛繼榮

福建省中醫藥研究院骨質疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州 350003

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是常見的老年性疾病，發病率高。中醫藥能顯著改善骨質疏松癥癥狀、防治并發癥、提高生存質量和延長壽命等。但是中醫藥強調其基本理論及原理的闡述，對現代疾病生物學本質的探索不足，如能在生物學層面運用現代生物學技術對中醫證候的實質進行深入的闡述，這將更有利于中西醫的溝通與結合。表觀遺傳學是當前研究的一個熱點，它能很好地闡述“遺傳-環境-疾病”相互作用機制和關系，而這種“環境疾病”模式與傳統中醫理論中“天人合一”的整體觀相符。所以將表觀遺傳學的概念及相關技術引入到中醫基礎理論的研究會有所突破，并有新發現的可能。

miRNA作為表觀遺傳學主要研究的內容之一，主要作用環節在基因轉錄后進行調控。miRNA是一類存在于真核生物體內，長22～25 bp的內源性非編碼單鏈RNA分子，通過與靶基因的特異性堿基配對引起靶序列降解或翻譯阻遏，從而對靶基因的表達進行轉錄后水平的調控[1-3]。研究表明miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括細胞增殖、分化、凋亡、發育等多種生物學過程[4]。課題組前期已經多次應用全基因組表達譜芯片技術開展證候-基因組研究，發現腎陰虛證主要集中于代謝、免疫功能類基因的表達異常[5-7]。在此系列研究的基礎上，本實驗選擇為基因調控環節的miRNA，計劃在沿用病癥結合的研究思路基礎上，采用miRNA芯片，觀察PMOP腎陰虛證的miRNA表達變化情況，旨在為闡明PMOP腎陰虛證的本質及為治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用病例對照研究方法，選擇絕經后2年以上、75歲以下的受試者，對受試者進行問卷調查，檢測肝腎功能、血尿常規、心電圖和B超等。雙能X線骨密度儀檢測正位腰椎L1～4和左側股骨上端骨密度，中醫辨證，分組如下：PMOP腎陰虛組3例，PMOP腎陽虛組3例，健康絕經后婦女3名作為對照組。本研究方案獲得福建省中醫藥研究院中醫藥臨床研究倫理委員會審批通過。(1)診斷標準：骨質疏松癥診斷參照《中國人骨質疏松癥建議診斷標準》(第2稿)[8]，中醫證候診斷標準參照《中醫虛證辨證參考標準》[9]。(2)納入標準：符合骨質疏松癥診斷標準；符合中醫辨證標準；年齡在46～75歲，自然絕經2年以上的漢族婦女；受試者知情同意。(3)排除標準：不符合骨質疏松癥診斷及中醫腎陰虛證辨證標準者；類風濕性關節炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進等繼發性骨質疏松癥者；合并有心腦血管嚴重疾病者；肝、腎功能檢查異常者；最近一個月用過中藥治療骨質疏松癥者，或近3個月內用激素替代治療、使用降鈣素者，或近6個月內有連續15 d用雙膦酸鹽等防治骨質疏松癥者。

1.2 用miRNA芯片技術檢測miRNA表達譜及篩選差異表達基因

1.2.1樣品RNA提取和質檢：取外周血5 mL，淋巴細胞分離液提取靜脈血中的單個核細胞，使用Trizol法提取細胞的總RNA，Nanodrop測定RNA 260/280的吸光度及濃度，用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。

1.2.2芯片雜交及掃描：基因芯片使用Agilent miRNA芯片，委托北京博奧生物技術有限公司進行。對Total RNA進行純化，純化后重新定量。Total RNA 的去磷酸化、標記、雜交，在洗液中清洗甩干后，使用 Agilent 芯片掃描儀對芯片進行掃描，得到雜交圖片。

1.2.3圖像采集和數據分析：使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數據，然后使用Agilent Gene Spring軟件對數據進行歸一化和差異分析。基于數據庫KEGG查詢差異涉及miRNA的信號通路，及相關靶基因數據庫分析序列以及預測靶基因。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計，計量資料用均數±標準差表示，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 受試者數量分析

納入對象9人均進入結果分析，無中途退出者。

2.2 PMOP腎陰虛證組與其他2組miRNA表達譜的差異性分析

PMOP腎陰虛證組與對照組相比，篩選差異表達miRNA49條；PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽虛證組相比，篩選差異表達miRNA71條；PMOP腎陰虛證組分別與其他2組比較，有20條共同的差異表達miRNA，與正常對照組相比，其中表達上調的miRNA有17條，表達下調的miRNA有3條(見表1)。

表1 PMOP腎陰虛證組與其他2組比較共同差異表達miRNATable 1 Differential expression of miRNA in Kidney Yin deficiency group compared with the other two groups

2.3 實時熒光定量PCR驗證芯片結果

根據miRNA表達譜芯片檢測的結果，隨機選取3個表達變化顯著的miRNA (hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p)用實時熒光定量PCR再次驗證，內參選擇snRNAU6。結果顯示(圖1)，與對照組相比，PMOP腎陰虛組hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p表達水平明顯升高(FC=3.56、4.20)，hsa-miR-95-3p表達明顯下調(FC=2.10)，3條miRNA在芯片樣本中得到較好的驗證，qPCR的結果與芯片數據趨勢一致。

圖1 定量PCR驗證基因芯片的結果Fig.1 Confirmation of microarray results using quantitative PCR

2.4 差異表達miRNA的pathway分析

將差異表達的miRNA用KEGG數據庫進行pathway分析，選取前30個顯著富集的kegg通路，根據P值繪制成柱狀圖(圖2)，主要包括代謝通路、癌癥通路、Rap1信號通路、粘著斑信號通路、PI3K-Akt、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、內質網蛋白加工、cGMP-PKG信號通路、Ras信號通路、Wnt信號通路。

2.5 差異表達miRNA的靶基因預測

為了更全面地了解PMOP腎陰虛證相關miRNA的功能，同時采用miRWalk、Microt4、miRanda、miRdb、miRMap、PicTar2、PITA、RNA22、Targetscan、RNAhybrid 10個數據庫逐一預測這20個miRNA的靶基因，進行綜合統計分析，最終結果取6個數據庫預測結果的重疊部分，為了進一步縮小靶基因預測范圍，從結果中挑選出同時被5個miRNA同時作用的靶基因，共9個(見表2)。

3 討論

隨著對miRNA功能研究的深入，越來越多的研究發現miRNA與人類疾病的發生發展過程密切相關。miRNA在細胞生長和發育過程中起多種作用。許多miRNA被證明在骨代謝中都起到了關鍵的調控作用，參與維持骨代謝的平衡。例如miR-133 a和miR-204通過抑制成骨分化中關鍵的轉錄因子Runx2，抑制成骨細胞分化[10-11]；有些miRNA在骨重建過程中有雙重作用，如miR-214既能促進破骨細胞形成，同時也能抑制骨形成[12-13]。對這些miRNA的深入研究可以為骨代謝的疾病診斷與治療提供新的思路與方法。本研究以miRNA芯片技術為研究手段，通過探討PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽虛證組和健康絕經后婦女3組miRNA基因差異的表達情況，揭示與PMOP腎陰虛證相關的miRNA表達譜特征，旨在整體miRNA表達水平闡明POP腎陰虛證的本質。研究結果發現腎陰虛證組與對照組、腎陽虛證組的差異表達miRNA分別為49條、71條；腎陰虛證組與其他兩組比較，篩選出20條共同差異表達miRNA，和對照組相比，其中表達上調的有17條，表達下調的有3條。隨后挑選hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p這3條miRNAs進行qPCR驗證，證實qPCR的表達數據與芯片數據趨勢一致。

圖2 顯著富集的kegg信號通路Fig.2 Significantly enriched kegg pathway

表2 差異表達miRNA的靶基因預測Table 2 Target gene prediction results of differential expression of miRNA

miRNA是機體中一個龐大復雜的調控網絡體系，對miRNA相關信號通路的研究是了解其調控機理的重要方式。筆者對這些差異miRNA進行根據pathway分析，發現這些miRNA主要參與代謝通路、癌癥通路、Rap1信號通路、粘著斑信號通路、PI3K-Akt、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、內質網蛋白加工、cGMP-PKG信號通路、Ras 信號通路、Wnt信號通路的調控等。研究證實，這些信號通路的多條通路都參與了骨代謝的調控。PI3K-Akt信號通路廣泛存在于細胞中，能調控成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化及凋亡[14-15]，Akt及其下游的靶基因是骨形成的關鍵調控者。Wu等[16]研究證實四物湯的提取物可以通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路促進骨形成進而防止骨質疏松。MAPK 信號通路主要包括 ERK1/2通路、JNK 通路、P38 通路和 ERK5通路。Kim等[17]的研究結果表明膠原蛋白水解物可以通過ERK/MAPK通路促進成骨細胞分化和增殖； Hah等[18]實驗說明JNK 通路在成骨細胞分化和生存中具有重要作用；Choi等[19]和Rodríguez-Carballo等[20]報道了P38通路可以通過促進骨形成和抑制破骨細胞分化改善骨質疏松。Wnt信號通路對成骨細胞的分化和骨形成具有重要的促進作用，它可以通過調節Runx2等成骨標志性基因的表達，促進成骨細胞分化[21]。此過程對于骨形成非常重要，當該通路紊亂時會導致骨質疏松。由于Wnt信號通路在成骨細胞中扮演著重要角色，已成為藥物設計的靶標，并被成功地應用于臨床。如Romosozumab藥物已經完成臨床II期研究階段，目前正在進行III期臨床項目。Romosozumab是一種全人源化單克隆抗體，通過抑制骨硬化蛋白活性，激活Wnt通路而促進骨形成，從而促進成骨作用[22-23]。總之，骨質疏松發病機制復雜，多種相關信號通路之間存在交互和交叉的作用，具體機制還需進一步深入研究。

miRNA功能研究的重點在于對其靶基因調控的研究。miRNA通過精確地調控靶基因表達進而參與細胞的生長、發育、分化、凋亡等生物學過程。通過實驗結合生物信息學的方法，2009年Friedman等[24]預測，miRNA作用的靶基因數量超過45 000個，調控了人類2/3以上的蛋白質編碼基因。一個miRNA可以有不同的靶基因，一個靶基因也可以由多個miRNA調控。通常認為，受多個miRNA同時作用靶基因更有可能發揮重要作用[25]。筆者最終篩選出9個miRNA的靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148)，其中SOX11、PHF20基因被認為與骨的生長、發育相關。SOX11基因在許多干細胞中都有表達，包括骨祖細胞，在細胞的發育過程中，SOX11基因對于細胞的存活和分化起了重要作用，并能通過誘導生長板的形成促進骨骼生長[26]。SOX11基因過表達可以顯著促進老鼠骨髓基質干細胞向成骨細胞分化[27]，機制可能是通過促進成骨細胞重要的轉錄因子Runx2和OSX的表達，進而促進成骨分化[28]。大鼠全身性敲低PHF20基因會表現出腰椎發育異常[29]，研究其發病的具體機制，Yang等[30]通過過表達PHF20基因，發現它可以增加ALP活性和骨礦化形成，及骨形成標志物Runx2的表達，進而促進成骨細胞分化。相反，抑制PHF20表達會降低骨形成及骨礦化作用。

綜上所述，本實驗采用miRNA芯片技術研究PMOP腎陰虛證中差異表達miRNA，并對這些miRNA進行pathway分析及靶基因預測。結果表明，這些差異表達miRNA可能通過調控PI3K-Akt、MAPK、Wnt信號通路等與骨代謝相關信號通路參與PMOP腎陰虛證的發生發展過程。這只是對PMOP腎陰虛證miRNA基因表達譜的初步探討，今后需要擴大樣本驗證miRNA，及進一步探討miRNA與靶基因的關系，并對miRNA進行體內實驗功能驗證。通過對差異miRNA及其調控的靶基因深入研究，將有助于理解PMOP腎陰虛證的本質及為治療提供新的思路與方法。