長春市漢族女性維生素D受體基因BsmⅠ和FokⅠ位點多態性與骨密度相關性研究

馬倩倩 毛未賢 高遠 宋世凱 尹紀偉 張萌萌

吉林省骨質疏松診療中心(吉林大學第四醫院)，長春 130011

維生素D是維持正常骨代謝的重要調節因子，維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是介導1,25-(OH)2D3發揮生物效應的核內生物大分子，屬于類固醇/甲狀腺激素受體超家族成員[1]。自1994年Morrison等[2]首次揭示VDR基因多態性與骨密度(bone mineral density，BMD)有關聯以來，VDR基因已成為國內外研究最廣泛的與骨代謝相關的基因之一。VDR基因多態性分別對應多個酶切位點，其中研究較深入的有BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ4個位點，但是不同種族、不同地區研究結果不盡相同[3]。本文研究長春市230例35～85歲漢族女性BsmⅠ、FokⅠ位點多態性及其BMD的相關關系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取我院體檢和住院的長春市230例35～85歲漢族女性，平均年齡(58.5±12.2)歲。在長春市長期居住10年以上且相互無血緣關系，排除急、慢性肝、腎疾病、糖尿病、高血壓、甲狀旁腺機能亢進、甲狀旁腺機能減退、甲亢、甲減、腫瘤及放化療患者。記錄受試者一般情況，按照絕經情況分為絕經組142例[(64.9±8.1)歲]和未絕經組88例[(45.3±5.8)歲]。

1.2 實驗儀器

德國Eppendorf Mastercycler pro梯度PCR儀，美國伯樂Biorad 164-5052電泳儀，美國SYNGENE凝膠成像系統，Hologic Discovery WA型骨密度儀。

1.3 方法

1.3.1提取基因組DNA：抽取230例受試者外周靜脈血3 mL，采用磁珠法DNA提取試劑盒(長春志昂生物科技)，嚴格參照試劑盒說明進行操作。

1.3.2引物設計與合成：BsmⅠ位點：上游引物5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′，下游引物5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′；FokⅠ位點：上游引物5′-AGCTGGCCCTGGCACTGAC TCTGCTCT-3′，下游引物5′-ATGGAAACACCTT GCTTCTTCTCCCTC-3′(吉林省庫美生物合成)。

1.3.3PCR：提取的DNA模板4.5 μL，10 μM上下游引物各1.5 μL，2×Taq PCR Mix 15 μL(康潤生物)，去離子水7.5 μL補至30 μL反應體系。94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環。

1.3.4限制性內切酶酶切分析：取PCR產物10 μL，加入BsmⅠ/FokⅠ快速內切酶(美國Thermo Fisher)1 μL，10×FastDigest Buffer 2 μL，去離子水17 μL補至30 μL反應體系，37 ℃水浴5 min進行酶切，65 ℃水浴5 min終止反應。2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，紫外凝膠成像系統下觀察條帶，650 bp和175 bp兩條帶為bb型，825 bp一條帶為BB型，825 bp、650 bp和175 bp 3條帶為Bb型；265 bp一條帶為FF型，196 bp和69 bp兩條帶為ff型，265 bp、196 bp和69 bp 3條帶為Ff型。

1.3.5采用Hologic Discovery WA型骨密度儀檢測腰椎正位(L1～4)BMD，每次開機后均用模體校正，測量誤差小于0.5%。

1.4 統計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，基因型頻率分布采用χ2檢驗，各基因型BMD分析采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在本研究人群中，BsmⅠ位點基因型以bb型為主，占83.9%，BB型只發現8例，占3.5%，Bb型占12.6%，b等位基因頻率高達90.2%，B等位基因頻率為9.8%；FokⅠ位點基因型ff、Ff和 FF分別占18.3%、43.9%和37.8%，f等位基因頻率為40.2%，F頻率為59.8%，兩位點基因分布均符合Hardy-Weinberg定律(χ2=1.283，P=0.125；χ2=0.96，P=0.342)；未絕經組與絕經組各基因型分布組間差異無統計學意義(P>0.05)；BsmⅠ位點在未絕經組和絕經組中各基因型BMD差異無統計學意義(P>0.05)；FokⅠ位點ff型BMD較FF型和Ff型低，但在未絕經組中差異無統計學意義(P>0.05)，絕經組中ff型與FF型比較，BMD差異有統計學意義(P<0.05)。

230例受試者BsmⅠ和FokⅠ酶切位點基因型及等位基因頻率分布見表1，未絕經組與絕經組BsmⅠ、FokⅠ位點基因型分布見表2、3，BsmⅠ和FokⅠ兩個位點各基因型腰椎(L1～4)骨密度值見表4。

表1 BsmⅠ和FokⅠ位點基因型及等位基因頻率分布Table 1 BsmⅠand FokⅠgenotype and allele frequency distribution

表2 未絕經組與絕經組BsmⅠ位點基因型分布Table 2 BsmⅠgenotype distribution in premenopausal group and postmenopausal group

表3 未絕經組與絕經組FokⅠ位點基因型分布Table 3 FokⅠgenotype distribution in premenopausal group and postmenopausal group

3 討論

骨質疏松癥是遺傳和環境因素共同參與的多因子復雜疾病，VDR基因是目前研究最廣泛的與骨代謝相關的基因之一[4]。VDR等位基因多態性與骨密度、骨轉換、腸道鈣吸收存在一定關聯，能特異地結合1，25(OH)2D3并作用于靶細胞核，發揮調節成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞分化、增生的生物學作用，從而影響骨鈣化、骨骺生長[5]。受性別、年齡、民族、受試人種、樣本量、環境影響等多種因素影響，目前VDR基因BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ等位點多態性與骨質疏松的研究結論沒有一致的結果[3]。

在BsmI酶切位點，Saadi等[6]報道了我國人群B等位基因頻率不到10%。王秀玲等[7]研究顯示，哈爾濱地區部分漢族人群b等位基因出現的頻率為91.8%，B等位基因出現的頻率為8.2%，BB型占0%，Bb型占16.3%，bb型占83.7%。在本研究人群中，BsmⅠ位點基因型以bb型為主，占83.9%，BB型占3.5%，Bb型占12.6%，b等位基因頻率高達90.2%，B等位基因頻率為9.8%，與Saadi等[6]、王秀玲等[7]的研究結果基本一致。與Zhang等[8]對中國漢族絕經婦女研究結果接近(bb、Bb、BB基因型分布分別為90.5%、9.5%、0%)，與朝鮮族絕經期婦女的研究結果不一致(bb、Bb、BB基因型分布分別為38.1%、55.56%和6.35%)。與韓國人相似(11%左右)，略低于日本人(15%～20%)[9]。而與美國及其他西方國家的研究結果不同，美國、澳大利亞以Bb基因型最多[10]。提示種族不同，導致VDR基因多態性的差異。

表4 BsmⅠ和FokⅠ兩個位點各基因型腰椎(L1～4)骨密度值比較(g/cm2)Table 4 Spine lumbar (L1-4) BMD value of each genotype of BsmⅠand FokⅠ(g/cm2)

注：*表示ff基因型骨密度值與FF型比較差異有統計學意義(P<0.05)，其他各基因型骨密度差異無統計學意義(P>0.05)。

本研究結果顯示BsmⅠ位點各基因型BMD差異無統計學意義(P>0.05)。與繆應新等[11]對611名上海地區漢族人VDR基因型與BMD關系的研究結果一致，認為VDR基因型和BMD無關聯。吳文等[12-13]對廣州地區絕經后婦女VDR基因多態性與BMD關系的研究結果顯示，bb與Bb、BB基因型在腰椎BMD差異有統計學意義(P<0.05)，而對絕經前婦女的研究結果顯示各基因型與BMD無關。

FokI多態性位點位于VDR基因第2外顯子的起始區，是目前所了解的VDR基因多態性中惟一個改變氨基酸序列長度的位點。VDR基因中FokI位點基因型以Ff為主[5]。在本研究結果中，Ff型占 43.9%，ff和FF分別占18.3%、37.8%。與韓昕等[14]對北京地區230名健康漢族男性FokⅠ多態性研究結果基本一致(FF占36.96%，Ff占46.96%，ff占16.08%)。與Morita等[15]所報道的日本女性結果接近(FF占38.7%，Ff占47.7%，ff占13.6%)。

本研究顯示，FokⅠ位點ff型BMD較FF型和Ff型低，但在未絕經組中差異無統計學意義(P>0.05)，絕經組中ff型與FF型比較差異有統計學意義(P<0.05)。與韓昕等[14]對北京地區漢族男性FokⅠ多態性位點與BMD關系的研究結果相似，該研究顯示40～59歲年齡段男性ff基因型腰椎L2～4BMD較FF型低(P=0.001)。Yasovanthi等[16]研究也顯示FokⅠ基因多態性與低骨量有關。Kalak等[17]在波蘭西部地區的研究發現該地區人群腰椎BMD ff(0.792 g/cm2)

綜上所述，本研究顯示VDR基因多態性與性別、年齡、民族、樣本量、環境影響等多種因素相關，目前對女性VDR基因多態性與BMD的研究較多，但兒童和男性的研究較少，因此仍需開展更多高質量大樣本的研究進一步驗證。本研究工作仍在進行中，以后將進一步增加男性受試者和總的樣本量，以期更好地評價VDR基因多態性對骨質疏松的影響。