神經肽Y在骨微損傷修復機制中的作用

謝瑋鑫 王雙磊 李展春

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院骨科，上海 200127

骨微損傷是指骨疲勞導致的骨顯微結構改變的結果[1]，骨的周期性和疲勞性負載可引起骨微損傷以及微損傷的聚積，最終發生骨折。骨骼具有自我修復的能力，大量實驗通過誘導微損傷形成來研究其修復機制，發現骨組織可對微損傷進行“靶向重建”[1-3]，因此研究骨微損傷的修復機制對于骨質疏松性骨折的早期診斷與治療有著重要意義。近年來，越來越多的神經肽被發現對骨代謝有調節作用，其中神經肽Y(neuropeptide Y, NPY)在骨重建過程中起到重要作用。本文綜述了NPY在骨微損傷修復機制中的作用，旨在為相關深入研究以及骨質疏松骨折的早期診斷與治療提供一定的理論基礎。

1 骨重建在骨微損傷修復中的作用

骨重建包括兩個重要的步驟：破骨細胞介導的骨吸收以及成骨細胞介導的骨形成[4-6]。成人骨重建在骨吸收以及骨形成之間需要一個精確的平衡[7,8]，如果兩者失衡，如骨吸收超過了骨形成的代償，就會導致骨質疏松[9]。

研究表明骨組織通過啟動骨重建來修復骨微損傷[2, 10]。Bentolila等[10]在對鼠尺骨施加疲勞負載后觀察發現，10 d后骨微裂縫的數量密度較之前減少了40%，Allen等[11]報道了在使用雙膦酸鹽抑制了40%～50%的骨重建之后導致損傷區域擴大3倍，并且Allen等[12]還發現通過雷洛昔芬更輕微地抑制20%的骨重建之后出現了雙倍的微裂縫數量，提示骨重建的抑制程度才是微損傷修復的首要問題。可以看出骨重建在骨微損傷修復中有著重要的作用。

Bentolila等[10]通過鼠尺骨疲勞模型研究首先提出不同微損傷類型對骨重建的影響不同，后來的多項研究也發現線性微損傷可啟動骨重建，而彌漫性微損傷沒有骨重建活動或微裂縫修復有效性顯著低于線性微裂縫[2, 10]，近年來，Herman等[1]的研究也支持上述結論。線性微損傷啟動骨重建的機制目前尚未明確，骨細胞凋亡被認為是線性裂紋啟動骨重建的一個重要機制。Kennedy等[13]研究發現骨微損傷區域的吸收陷窩內出現大量凋亡骨細胞，并且這些凋亡細胞對于骨重建有重要意義。Herman等[1]研究發現骨疲勞負載后藥物抑制骨細胞凋亡可以阻止骨重建的激活，Tami 等[14]認為線性微損傷影響局部骨細胞間小管液的運輸，從而引起骨細胞缺氧應激而導致骨細胞凋亡。Cheung等[15]與Kennedy等[16]認為這些凋亡骨細胞可以促進鄰近正常骨細胞釋放破骨細胞募集因子如RANKL等，從而激活骨重建。另外，小管液的滲漏可能伴隨類似破骨細胞趨化因子的釋放而募集破骨細胞，從而啟動骨重建[17]。綜合以上研究，骨細胞凋亡在微損傷啟動骨重建過程中起到重要作用，線性損傷可能通過周圍局部骨細胞的凋亡激活破骨細胞在骨微損傷區域去除損傷的骨基質，啟動骨重建。

2 NPY系統在骨重建中的作用

NPY 是一種含36 個氨基酸的多肽，主要由中樞以及外周神經系統合成，其效應主要由G蛋白偶聯受體家族介導。目前發現NPY系統主要有5種受體，分別為Y1，Y2，Y4，Y5和Y6[18]，各種受體的分布不相同，在與NPY的親和力方面，Y2>Y1>Y5，Y4=Y6[18]。研究認為Y1和Y2在骨重建中起到較為重要的作用。Y1和Y2均大量表達于中樞神經系統，然而分布區域并不完全相同。在中樞神經系統，NPY在下丘腦弓狀核表達最為豐富[18]。這些NPY能神經元主要表達高水平的Y2受體，并且投射到其他區域，例如富含Y1受體的室旁核[19]。近幾年，NPY受體也被發現表達于外周，例如在成骨細胞以及骨細胞發現表達有Y1受體[20, 21]。研究發現NPY在小鼠下丘腦特異性過表達可顯著降低成骨細胞成骨能力[22]，并且在皮質骨以及松質骨中礦化和未礦化的骨形成速率顯著降低(7倍以上)。另外，NPY基因敲除小鼠的皮質骨橫截面積與厚度顯著增加，也與骨形成增加有關[22]。可以看出NPY在骨重建中起到重要的作用，該作用主要由Y2和Y1介導。

2.1 Y2受體在骨重建中的作用

2.1.1Y2受體對骨代謝的作用

Y2受體主要表達于中樞神經系統，包括海馬和下丘腦的特定區域，在下丘腦的弓狀核尤其豐富[23, 24]。研究證明基因敲除小鼠下丘腦Y2受體可促進骨形成，使松質骨以及密質骨的骨量增加[24,25]。Baldock等[24]的研究發現無論是Y2受體基因全部敲除還是條件性敲除下丘腦神經元Y2受體基因，都可以刺激成骨細胞活動增加，觀察到松質骨的體積顯著增加以及成骨細胞礦化沉積率(mineral apposition rate, MAR)顯著增加，沒有證據顯示骨吸收指數以及破骨細胞數量的改變。另外Baldock等發現在骨組織中缺乏Y2 mRNA，提示Y2受體在骨組織中沒有表達。Sainsbury等[26]研究發現Y2-/-; Y4-/-小鼠與Y2-/-小鼠比較，在松質骨體積以及成骨活動上呈現協同作用(3倍)，而密質骨的骨量顯著下降。以上研究表明，Y2受體主要通過降低成骨細胞成骨作用來調節骨重建，對破骨細胞活動調節無明顯效應。

Y2受體還被發現對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的活動起到重要作用。Lundberg等[21]體外去神經培養Y2-/-小鼠BMSCs，與對照組相比，Y2-/-小鼠存在時間依賴性的礦化作用增強，并且礦化模式更加均勻分布。成骨標志堿性磷酸酶以及骨鈣蛋白也被發現顯著增加。另外還發現間充質干細胞數量是對照組的2倍，在接種不成熟以及成熟間充質干細胞后發現Y2-/-組與對照組的集落形成能力未見明顯差異，提示Y2-/-組的骨形成增強作用可能與間充質干細胞數量增多有關。

研究認為瘦素(leptin)與Y2受體在骨形成活動上有密切聯系。瘦素作為一個脂肪因子，常被關注于其對脂肪代謝的作用。目前已證實其對骨形成活動的調節也有重要作用，與Y2受體不同的是，瘦素在松質骨以及密質骨上的骨代謝調節起相反作用，瘦素基因敲除可抑制密質骨形成，促進松質骨形成[25,27]。與Y2受體相同的是，瘦素受體也由下丘腦弓狀核的NPY表達神經元表達，因此兩者極有可能通過某些共同的通路起到骨代謝調節作用。Baldock等[25]對比了Y2-/-、ob/ob以及Y2-/-；ob/ob三組小鼠，發現ob/ob和Y2-/-；ob/ob二者的松質骨體積無明顯差異，但是較Y2-/-組少。另外ob/ob以及Y2-/-；ob/ob的成骨細胞功能無明顯差異，表明在無瘦素情況下Y2受體缺失并沒有額外的成骨刺激效應，而當瘦素存在時，Y2受體缺失可使成骨細胞活動提高2倍，提示容許水平的瘦素可能可以激活Y2受體依賴的骨代謝通道。

2.1.2Y2受體調節血管生成的作用

脈管系統對于骨的生長以及骨重建有著至關重要的作用[28]。研究認為血管生成與骨形成是偶聯的[29]。骨重建過程發生于一種特殊的血管化結構，稱為骨重建單位[28](bone remodeling units, BRUs)。BRU可以促進成骨細胞與破骨細胞前體之間的相互作用，成骨細胞分泌的RANKL可以促進破骨細胞的分化與激活[30,31]。Song等[29]認為絕經后骨質疏松的骨髓中毛細血管和血竇數量減少以及骨灌注減少。因此血管生成在骨重建過程中有著重要的作用。

研究[32-34]發現NPY有刺激血管平滑肌生長以及促進血管上皮細胞的增殖以及遷移的作用。Ekstrand等[35]發現對角膜模型應用Y1受體激動劑后并未觀察到血管生成的反應，而在Y2受體缺失的小鼠模型中，NPY無法誘導血管生成，提示Y2介導血管生成通路。另外Ekstrand等[35]發現在NPY以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等細胞因子作用下的新生血管的血管內皮細胞都表達有Y2受體，而沒有Y1受體，Y1受體僅表達于血管平滑肌細胞，而血管上皮細胞是唯一一種形成初級血管叢的細胞類型，因此Y2受體的作用可能為引導血管的生長，而當微血管生成，其他的細胞類型包括血管平滑肌細胞等在Y1受體的介導下被招募以重建新生血管。Alasvand等[36]在應用了Y2受體阻滯劑BIIE0246后發現可以減少腫瘤組織的毛細血管密度，提示Y2受體阻斷可以抑制腫瘤血管形成。Ekstrand等[35]發現Y2受體基因敲除鼠的皮膚愈合較對照組慢，并且在外源性NPY的介入下，NPY可以促進對照組小鼠的皮膚愈合，卻無法促進Y2受體基因敲除鼠的皮膚愈合。以上研究均表明了Y2受體在促進血管生成中起到重要的作用，這在骨重建過程可能起著重要的作用。

關于Y2受體激活刺激血管生成的機制目前尚未明確。VEGF是刺激血管生成的一種主要的細胞因子，Ekstrand等[35]發現 VEGF誘導的新生血管同樣表達有高水平的Y2受體，并且Alasvand等[36]發現Y2受體抑制劑可以顯著減少肥胖組小鼠的血清VEGF 濃度，以及抑制腫瘤血管形成，提示NPY與VEGF在血管生成方面可能有一定的聯系。NO在VEGF刺激血管生成的過程中發揮關鍵的作用，Troke等[37]發現Y2受體能抑制腺苷酸環化酶，從而抑制ATP轉換為cAMP。cAMP的減少影響了鈣與鉀離子通道，并且動員胞內鈣離子，鈣離子與鈣調蛋白結合激活上皮細胞eNOS，促進NO的生成。Saraf等[38]認為NPY與Y2受體結合后促進NO的合成，NO反過來上調NPY以及VEGF等的表達，最終產生血管形成的效應。因此，VEGF與NO在Y2受體激活促進血管生成中起到了重要的作用。

2.2 Y1受體在骨重建中的作用

2.2.1Y1受體對成骨細胞的作用

研究[39, 40]發現鼠Y1全部敲除可以增加成骨細胞活動，引起松質骨與皮質骨體積增加。然而僅敲除下丘腦Y1受體時骨的表型并未發生改變，提示對骨代謝起調節作用的Y1受體并不存在于下丘腦。另外下丘腦Y1-/-、Y2-/-以及Y1-/-;Y2-/-雙敲除三組比較，亦無明顯差別，提示NPY對骨代謝的調節可能是通過Y1與Y2受體共同參與的一條通路，只是兩者的分布的位置不同。Lundberg等[21]通過原位雜交顯示在股骨內皮質和松質骨表面的成骨細胞表達Y1受體而沒有Y2受體，進一步證實了以上觀點。Lee等[41]認為下丘腦的NPY與Y2受體結合，通過交感神經元釋放NPY并與成骨細胞的Y1受體結合，從而抑制骨形成。關于Y1與Y2在骨代謝方面作用的關系還需要更多研究來證實。

事實上，研究證明Y1受體表達于成骨細胞表面[20, 21]，Y2受體在骨組織中沒有表達[24]，因此NPY系統可能通過局部表達的Y1受體來直接調節成骨細胞的合成代謝作用。近年已有研究表明成骨細胞表達的Y1受體在骨形成過程中起到成骨性的作用[20,23,42]。Lee等[42]通過基因敲除小鼠成骨細胞Y1受體，證實Y1-/-小鼠的股骨松質骨體積、骨小梁厚度以及骨小梁數量顯著增加，說明其礦化沉積率以及骨形成率增高，反映成骨細胞活動的增強。Lee等通過特異性敲除幼稚[43]與成熟[42]骨細胞，發現松質骨與密質骨的骨量均明顯增加。Baldock等[23]的研究與上述結論一致。綜合以上，Y1受體可通過對成骨細胞活動的影響來調節骨重建，對骨重建起到重要作用。

Liu等[44]研究發現NPY可以呈濃度依賴性促進BMSCs的成骨細胞分化作用，并且可以上調β-catenin 以及p-GSK-3β的表達，該作用可以被Y1R抑制劑以及Wnt通路抑制劑抑制，提示NPY與Y1R激活可以促進BMSCs的成骨分化作用并且該作用與經典Wnt通路有關。然而Lee等[20]的研究提示Y1-/-小鼠有更強的間充質干細胞增殖以及成骨分化功能，提示Y1受體可直接抑制間充質干細胞向成骨細胞分化，并且在體外培養Y1敲除鼠的間充質干細胞表現礦化增強。有趣的是，上文提到Y2基因敲除鼠的間充質干細胞培養后表現出礦化增加以及骨祖細胞數量增加，Lundberg等[21]發現Y2基因敲除鼠成骨細胞的Y1受體表達明顯下調，提示Y2信號通路的阻斷介導了成骨細胞Y1受體表達下調。Lundberg等[21]認為由于Y2受體缺失導致NPY釋放增多，過度刺激Y1受體從而導致Y1受體表達下調。以上研究結果說明Y1受體調節間充質干細胞向成骨細胞分化以及礦化作用。

2.2.2Y1受體對破骨細胞的作用

值得注意的是，Y1受體在巨噬細胞功能中起到重要作用，而破骨細胞與巨噬細胞同是來源于造血干細胞單核/巨噬細胞系，因此可以推測Y1受體也可能表達于破骨細胞并對骨吸收發揮調節作用。Baldock等[23]研究發現Y1基因全部敲除小鼠的破骨細胞數量以及表面積顯著增加，而Lee等[42]僅敲除成骨細胞Y1受體后發現破骨細胞數量與表面積并未發生明顯改變。事實上曾有研究[45,46]表示NPY可以通過影響鼠骨髓細胞環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)以及骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的產生來調節破骨細胞生成，因此有學者認為由于Y1受體缺失導致成骨細胞活性的改變可能會影響到破骨細胞的活性。然而Matic 等[47]和Lee等[42]的研究表示不管是Y1受體全部敲除還是成骨細胞特異性敲除，RANKL/OPG均沒有明顯改變，因此關于Y1受體在破骨細胞方面的作用目前存在較大的爭議，還需要進一步研究。

3 展望

綜上所述，骨微損傷的累積是造成骨質疏松骨折的一個重要原因，NPY通過Y1受體與Y2受體直接或間接地參與骨微損傷修復并且在這個過程中起到重要的作用，其具體機制目前尚未明確，因此NPY對骨質疏松骨折等疾病的診斷與治療具有極為重要的潛在價值。進一步地研究NPY在骨重建過程中的機制對于骨質疏松骨折的早期防治具有重要的意義。