蒙醫常用藥狼毒對黑色素瘤治療的研究進展△

董文靜 李 明 董 武

(內蒙古民族大學動物科學技術學院，內蒙古 通遼 028000)

狼毒(Steller Chamaejasme)在中藥中屬于二級毒性藥物而禁用，有瑞香科狼毒和大戟科狼毒。但是狼毒是蒙醫上常見的有毒抗腫瘤蒙藥[1]。狼毒能夠治療水腫腹脹、痰、食、蟲積、心腹疼痛、慢性氣管炎、咳嗽和氣喘等癥狀，以及治療淋巴結、皮膚、骨和副睪等部位的結核、疥癬和痔瘺等疾病。狼毒有很好的抗癌作用，但也具有一定的毒性，家畜誤食后多表現為嘔吐、腹瀉、四肢無力和全身痙攣等急性中毒癥狀，嚴重時虛脫，甚至驚厥死亡，其中孕畜接觸會導致流產，人接觸時則會引起過敏性皮炎[2]。

隨著人們的生活水平的提高，危害人類健康的癌癥的發病率也不斷增加，黑色素瘤是較常見的惡性腫瘤，近年來已經成為發病率增長最快的腫瘤之一，據世界衛生組織(WHO)報道，全球每年有132,000的人患有黑褐素瘤，而且預計還會持續增長[3]。黑色素瘤的發病率較高，并且在黑色素瘤第四期快速轉移，手術效果不良，切除手術治療應該慎重選擇[4]。因此迫切需要尋找一種有效藥物來治療黑色素瘤。

有研究發現狼毒大戟提取液對小鼠體內惡性黑色素瘤B16細胞的生長有顯著的抑制作用,能顯著減緩腫瘤生長速度，狼毒能下調小鼠體內惡性黑色素瘤B16中Bcl-2/Bax凋亡蛋白的表達，預示凋亡細胞增加而讓腫瘤增長減緩[5]。Catherine M. Scahil等[6]研究發現斑馬魚的kdm2aa基因的缺失能夠導致高頻率的黑色素瘤，并且黑色素瘤是一種發生于黑色素細胞的惡性腫瘤，臨床研究發現在晚期黑色素瘤患者中發生了BRAF(V600E)的突變[7]，約50%的晚期黑色素瘤患者中有 BRAF( V600E) 突變，在一些研究中其突變率甚至高于 60%[8]。

1 狼毒化學成分

1.1 瑞香狼毒的化學成分 瑞香狼毒的化學成分復雜，60年代，我國學者就研究了狼毒的成分，而1982年Masaiake Niwa使用甲醇從瑞香狼毒中分離出瑞香烷型，即二萜成分,具有顯著的抗癌活性[9]。瑞香狼毒中的主要化學成分有二萜類、雙二氫黃酮類、香豆素類、木脂素和苯丙烯醇昔類等化合物。趙亮[10]通過液相色譜與質譜(GC-MS)研究瑞香狼毒提取液發現，其中化學成分含有黃酮類化合物，傘形花內酯及西瑞香素等香豆素類成分。其中黃酮類化合物含量較高，包括狼毒色原酮、狼毒素、異狼毒素、新狼毒素A、新狼毒素B和狼毒素C等雙二氫黃酮類衍生物。

1.2 大戟科狼毒化學成分 大戟科狼毒有月腺大戟和狼毒大戟兩類。熊爽[11]從月腺大戟根中分離得到了7種單體，分別是β-香樹脂醇乙酸酯(β-amyrinacetat e)，24-亞甲基環阿 爾廷醇(24-methylene cycloartanol)，3,3′-二乙酰基-4，4′-二甲氧基-2，2′，6，6′-四羥基二苯甲烷(3，3′-diacetyl-4,4′-dimethoxy-2，2′，6，6′tetrahy-droxy-dipheny-lmethane)，巖大戟內酯B(jolkinolide B),狼毒乙素(2，4-dihydroxy6-methoxy-3-methy-1-acetoph-enone),月腺大戟甲素(ebractedatanolide A)和β-谷甾醇(β-sitosterol)。鄧彬等[12]從月腺大戟(Euphorbia ebracteolata Hayata)植物根部分離得到8個化合物,分別是巨大戟二萜-3-肉豆蔻酸酯、巨大戟二萜-3-棕櫚酸酯、9,19-環阿爾廷-23E-稀-3β,25-二醇、24-亞甲基環阿爾廷烷-3,28-二醇、β-香樹酯醇乙酸酯、狼毒乙素、2,4-二羥基-6-甲氧基-3-醛基苯乙酮和月腺大戟素A。其中化合物巨大戟二萜-3-肉豆蔻酸酯、巨大戟二萜-3-棕櫚酸酯、9,19-環阿爾廷-23E-稀-3β,25-二醇、24-亞甲基環阿爾廷烷-3,28-二醇均為首次從該植物中分離得到。而狼毒大戟化學成分主要為二萜、三萜、鞣質、甾醇、蒽醌類等化合物。李青松等[13]用乙醇冷浸提取方法萃取，從狼毒大戟的乙酸乙酯部位得到狼毒乙素、2，4-羥基-6-甲氧基苯乙酮、東莨菪亭、東莨菪苷、二十四烷酸、丁香酸、正丁醇部位得到蔗糖。其中從狼毒大戟中首次分離得到東莨菪苷、二十四烷酸，丁香酸，正丁醇部位得到蔗糖。孫增玉等[14]在狼毒大戟的氯仿部位分離得到7個化合物，分別為23(Z)-環阿爾廷-23-稀-3β,25-二醇、22(E)-環阿爾廷-22-稀-3β,25-二醇、Jolkinolide B、2,4-二羥基-6-甲氧基-3-醛基苯乙酮、β-香樹脂醇乙酸酯、Antiquorin、二十四亞甲基環阿爾廷醇，其中二十四亞甲基環阿爾廷醇為首次從綠玉樹中分離得到。

2 狼毒抗腫瘤機理

段昕等[15]研究發現，瑞香狼毒總黃酮提取物明顯抑制人肺癌細胞A549細胞的增殖，并且隨著濃度的增加細胞的抑制率也增強。總黃酮提取物可誘導A549細胞細胞凋亡 ,并將細胞阻滯在G1 期。王蒙等[16]研究發現，狼毒大戟中松香烷型二萜內酯類化合物能夠抑制肝癌HepG-2、乳腺癌MCF-7、宮頸癌Hela、胃癌SGC-7901、BGC-823、MGC-80細胞的增殖。其中松香烷型二萜內酯類化合物jolkinolideB、17-hydroxyjolkinolide B對肝癌細胞的增殖有一定的抑制作用，jolkinolide A-、jolkinolideB、17-hy droxyjolki nolide B對乳腺癌細胞增殖有一定的抑制作用，jolkinolideB ，對胃癌BGC-823、MGC-803細胞的增殖有一定的抑制作用，17-hydroxyjolkinolide B對胃癌SGC-7901、MGC-803細胞的增殖有一定的抑制作用。jolkinolideB、17-hydroxyjolkinolide B對宮頸癌細胞的增殖有一定的抑制作用。王莉萍等[17]研究發現，狼毒提取液能夠下調抗細胞凋亡Bcl-2蛋白和上調促細胞凋亡Bax蛋白的表達、降低 Bcl-2 /Bax 蛋白比率，可能是狼毒提取液誘導腫瘤細胞凋亡、抑制惡性黑色素瘤 B16 細胞生長關聯的基因表達。王園園等[18]通過體內和體外實驗發現狼毒大戟提取液能夠抑制小鼠惡性黑色素瘤細胞B16生長和轉移，并且誘導小鼠惡性黑色素瘤細胞B16凋亡。通過上調PTEN蛋白表達并下調p-Akt蛋白的表達，降低、p-Akt、MMP-2及P70S6K1及基因含量，調控PI3K/Akt信號通路活化，抑制小鼠惡性黑色素瘤細胞B16的生長和轉移。通過腹腔注射狼毒大戟提取液發現可顯著抑制小鼠細胞移植瘤生長及降低肺轉移發生率，可上調B16小鼠移植瘤中的PTEN表達并下調p-Akt表達。最近周昕欣等[19-20]，通過抑制Bcl-2mRNA表達，增加Caspase3和Caspase9m RNA表達而誘導細胞凋亡而達到抑制癌細胞增長。由此可見狼毒提取液的腫瘤抑制作用有可能是通過激活細胞凋亡路徑或者活化PI3K/Akt信號通路。

3 黑色素瘤模型以及治療前沿

3.1 小鼠黑色素瘤模型的制作以及治療 小鼠作為黑色素瘤模型被廣泛應用，更加便于對黑色素瘤的治療研究。Perez-Torres, A.等[21]在母鼠側尾靜脈中轉移2105 數量的B16-f0黑素瘤細胞，1周后在皮下注射GK1肽，在外周血液中的INF顯著減少，淋巴細胞與對照組相比也有顯著的降低。延遲了腫瘤的生長，并增加了腫瘤細胞的內部壞死。通過進一步的研究來闡明GK1肽對黑素瘤的確切作用機制，以及它們最終在人類身上的應用。

3.2 斑馬魚黑色素瘤模型的制作以及治療 斑馬魚(Danio rerio)已經被確立為癌癥研究最重要的模型生物之一[22]，如皮膚癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病、神經膠質瘤和肺癌等[23-27]。斑馬魚黑色素瘤模型的發展，使我們能夠更好地了解腫瘤的病理機制，并有可能進行毒物篩選和藥物開發。KDM2A是一種與轉錄沉默有關的組蛋白，但是它對器官和疾病的作用卻很少有人知道。Kdm2aa在調節正常的mRNA水平和致癌作用方面，扮演著復雜的角色，當斑馬魚體內缺失kdm2aa序列會導致RNA轉錄被阻斷，有更高頻率黑色素瘤誘發。研究表明kdm2aa突變體是黑素瘤的第一個單基因淘汰模型[6]。眾所周知，腫瘤能夠誘導血管的生成，腫瘤血管生成多寡也預示癌癥治療結果的指標。斑馬魚腫瘤異種移植,在研究腫瘤血管生成方面是一個新興工具，通過斑馬魚腫瘤模型來快速、簡單、定量的來量化腫瘤血管生成[27]。Le X.等[28]將斑馬魚mitfa啟動子與人類致癌HRASG12V耦合制作黑色素瘤斑馬魚模型。通過某些基因敲除技術，以及給斑馬魚體內注射移植黑色素瘤細胞，制作斑馬魚黑色素瘤模型，來評價藥物的治療作用，得到非常成功的模型。

如今治療黑色素瘤的方式主要通過手術切除，治療藥物比較單一，8種FDA批準的藥物在我國也均未上市[29]。通過小鼠和斑馬魚黑色素模型，蒙藥狼毒提取物對黑色素瘤有良好的治療效果，但有關具體成分，治療機制還有必要進一步研究。我們使用人黑色素瘤細胞A2058細胞系，探討醋炮制狼毒提取液對黑色素瘤細胞的抑制作用，發現提取液能夠顯著殺死黑色素瘤細胞，使用斑馬魚胚胎作為實驗動物模型，發現不同炮制狼毒提取液(酸奶、訶子、醋、酒精和牛奶)能夠強烈誘導斑馬魚鰭細胞凋亡，高濃度可引起尾部組織的組織缺失[30]。使用斑馬魚胚胎作為模型，向斑馬魚胚胎注射人黑色素瘤細胞，然后使用狼毒提取液進行處理，以探討有關狼毒提取液的作用效果以及作用機制。

狼毒有抑制黑色素瘤生長的作用，但其成分，作用機理還有待進一步研究。斑馬魚胚胎作為黑色素瘤模型，具有潛在的應用價值，可以評價狼毒以及其他抗腫瘤藥物，具有廉價、敏感、容易觀察等眾多優點，建議在此方向有更多深入研究。

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