蒙藥珍寶丸對大鼠視網膜缺血再灌注損傷的神經保護作用△

包滿節 阿古拉 斯其宮 劉 慧

(1.北京中醫藥大學 2014級博士研究生，北京 100029；2.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；3.內蒙古醫科大學2015級研究生，內蒙古 呼和浩特 010110；4.內蒙古醫科大學附屬人民醫院病理科，內蒙古 呼和浩特 010020)

視網膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是眼科常見的一種臨床表現，是眼科臨床中失明、致盲性疾病的主要病理過程。視網膜缺血再灌注損傷的病理生理過程較復雜，目前為止，其發生機制尚未得到徹底闡明，研究表明RIRI是由多種因素有關，如氧自由基損害、基因調控、鈣超載、炎癥反應、興奮性氨基酸作用等等，最終結局為細胞凋亡。本研究采用急性高眼壓法建立RIRI模型，探討蒙藥珍寶丸對視網膜形態學結構及神經節細胞凋亡的影響，為防治視網膜缺血再灌注損傷性疾病提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 珍寶丸(Ⅰ號)(內藥制字M1401081)由內蒙古國際蒙醫醫院國家蒙藥制劑中心提供；復方托吡卡胺滴眼液(H20110093，參天制藥(中國)有限公司)購于內蒙古醫科大學附屬醫院藥房；鹽酸丙美卡因滴眼液(H20160133，S.A.ALCON-COUVREUR N.V.)，購于內蒙古國際蒙醫醫院藥房；原花青素(葡萄籽提取物)批號：002-1503012-27，天津市尖峰天然產物研究開發有限公司；用0.9%生理鹽水稀釋配制成10%水合氯醛，天津市北聯精細化學品開發有限公司提供。

TUNEL試劑盒：In situ cell death detection kit, POD，產品編號：11684817910，美國Roche公司；4%多聚甲醛液：由內蒙古醫科大學附屬人民醫院病理科提供；無水乙醇：天津市北聯精細化學品開發有限公司提供；伊紅染液和蘇木素染液：北京素萊寶科技有限公司提供。

1.2 動物 SD大鼠(280±20g)12只，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司動物中心提供[實驗動物生產許可證：SCXK-(軍)2012-0004]，動物一般狀態良好，皮毛光滑，進食與活動均正常，外眼及眼底檢查均正常。

1.3 儀器 包埋機：Leica EG1160 德國；切片機：H93/RM2126 德國；顯微鏡：尼康顯微鏡ECLIPSE LV100POL / 50IPOL 日本；圖像采集系統 Image Pro-Plus 6.0。

2 方法

2.1 用藥方法 隨機選取SD大鼠(280±20g)，分正常組、模型組、蒙藥組(珍寶丸)、中藥組(原花青素)，共4組，每組保證3只以上大鼠。將珍寶丸用開水浸泡、搗碎做混懸液備用。蒙藥組(0.54g/kg)和中藥組(0.81g/kg)1次/d，連續灌胃7d后，末次給藥6h后開始造模，次日處死大鼠。

2.2 大鼠模型的制作 選取各組大鼠稱體重，用 10% 水合氯醛0．35m L /100g 腹腔內注射麻醉、固定，雙眼進行造模，滴托吡卡胺滴眼液散瞳10min后滴鹽酸丙美卡因滴眼液眼表面麻醉，將連有無菌0．9%氯化鈉溶液輸液瓶的小兒頭皮針刺入大鼠眼前房，輸液瓶緩慢升高至150cm高度時大鼠眼內即形成110mmHg，造成視網膜缺血，1h 之后又緩慢降低輸液瓶高度，降低眼壓，虹膜及球結膜顏色迅速恢復正常，大鼠視網膜呈橘紅色，說明缺血再灌注損傷模型成功建立。

2.3 組織取材 再灌注24h后用10%水合氯醛深度麻醉大鼠致死后，迅速摘取雙側眼球，切除眼前節，放入4%多聚甲醛液中固定，沖洗后常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，平行于視神經矢狀軸連續切片，厚度為4μm。進行HE染色和TUNEL檢測并觀察視網膜病理學變化和細胞凋亡。

2.4 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木素液染色6min，雙蒸餾水沖洗兩次，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗，梯度酒精脫水；伊紅染色，體積分數95%酒精分色；無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

2.5 TUNEL檢測 使用美國Roche公司生產的TUNEL試劑盒進行檢測細胞凋亡，顯微鏡下見細胞凋亡位于細胞核，呈黃色或棕褐色。每眼每張免疫組化切片于200倍視野拍3張區域不同視野照片，應用Image pro-Plus 6.0圖像分析系統進行總細胞數和陽性細胞數，取平均值為該眼陽性細胞數。凋亡細胞數/總細胞數×100%記為凋亡指數(apoptosis index ,AI)。

2.6 統計學方法 采用SPPS20.0軟件進行統計分析。數據經正態性檢驗和方差齊性檢驗后，符合正態分布且方差齊的數據，組間進行單因素方差分析并進行兩兩比較，結果以(±s)表示，不符合則采用多個獨立樣本的非參數檢驗，用中位數(p25，p75)表示。

3 結果

3.1 HE染色結果 HE染色顯示正常組大鼠視網膜結構清晰，各層細胞排列緊密(ZC♀400倍)；模型組大鼠缺血再灌注損傷24h后視網膜細胞形態不規則，視網膜全層水腫，細胞排列明顯疏松、紊亂，細胞數量減少(MX♀400倍)；蒙藥組和中藥組，缺血再灌注損傷后24h，視網膜全層水腫，程度較模型組減輕，各層細胞形態較規則，細胞排列疏松、紊亂、比模型組較規整，視網膜較厚(MZ♀400倍、ZY♀400倍)。結果如圖1

3.2 TUNEL染色 陽性細胞為黃色或棕褐色，分布于細胞核，陽性細胞主要位于神經節細胞層。正常大鼠視網膜未見凋亡細胞(400倍); 模型組再灌注24h后，即可見視網膜神經節細胞凋亡明顯,與正常組相比，模型組凋亡細胞陽性率升高，差異有統計學意義P=0.004(400倍)；治療組再灌注24h后，與模型組相比，蒙藥組凋亡細胞陽性率降低，差異有統計學意義P=0.01(400倍)；與模型組相比，蒙藥組凋亡細胞陽性率降低，差異有統計學意義P=0.02(400倍)；治療組間無統計學意義，結果見表1和圖2。

表1 各組凋亡細胞陽性率比較 (P25,P75)

注：a：與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；b:與蒙藥組比較，差異有統計學意義(P<0.05)

4 討論

細胞凋亡這一概念于1972年首次由英國病理學家Kerr[1]等提出，隨之國內外越來越多的學者開始致力于細胞凋亡的深刻研究中。細胞凋亡(apoptosis)又稱為細胞程序性死亡，可引起形態學和生物化學的改變，發生在細胞，可導致其死亡[2]。研究證實，細胞凋亡是視網膜缺血再灌注損傷中神經細胞死亡的主要形式。本實驗運用高眼壓模型引起視網膜缺血再灌注24h后，用TUNEL檢測方法檢測凋亡細胞，可以觀察到神經節細胞層細胞核呈黃色或棕褐色，表明神經節細胞層細胞計數減少，證實神經節細胞因凋亡而減少。故此，本實驗高眼壓引起視網膜缺血再灌注損傷模型建立成功。

珍寶丸又名額爾敦-烏日勒，由珍珠、麝香、牛黃等29味天然藥物組合而成的其功能和療效猶如珍寶故此命名為珍寶丸。主治黑白脈病、薩病、痛風、風濕、麻風病、黃水病、腎熱、腎脈震傷、陳熱擴散于脈道筋脈抽搐、關節屈曲攣縮等癥[3]。現代藥理實驗證實：本方具有擴張毛細血管、改善微循環、降低血液黏度、改善血液流變性、抑制血小板凝聚、抗血栓、恢復神經損傷、清除氧自由基等作用[3]。此外，研究表明珍寶丸對家兔和大鼠高眼壓引起視網膜缺血再灌注損傷具有保護作用[4-6]。

我們在大鼠RIRI模型中運用病理切片和TUNEL檢測方法檢測了視網膜形態學結構及神經節細胞凋亡情況，發現大鼠視網膜缺血再灌注24h后視網膜細胞形態不規則，排列紊亂，視網膜變薄。細胞凋亡明顯，凋亡細胞為黃色或棕褐色，分布于細胞核。珍寶丸治療組的視網膜各層細胞形態較規則，排列整齊，細胞凋亡明顯降低與中藥組基本一致。因此，珍寶丸能夠抑制其細胞凋亡的發生，可以明顯減輕組織損傷，對視網膜神經細胞具有保護作用，其機制有待于進一步研究。

[1]J F R Kerr, A H Wyllie, A R Currie. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wideranging Implications in Tissue Kinetics[J]. British journal of cancer, 1972, 26(4):239.

[2]Marek.The role of the apoptosome in the activation of procaspase-9.[J]. Post py Higieny I Medycyny Do wiadczalnej, 2013, 67(863688):54.

[3]蒙古學百科全書編輯委員會.蒙古學百科全書·醫學[M].呼和浩特：內蒙古人民出版社，2012；(漢語版)：225-226.

[4]李常勝, 塔娜, 徹伊如格勒圖,等. 蒙藥額爾頓·烏日勒對視網膜缺血再灌注損傷大鼠血清中NO 和NOS的影響[J]. 內蒙古醫科大學學報, 2016, 38(6):568-571.

[5]吳薩日娜, 烏仁圖雅. 蒙藥珍寶丸對視網膜缺血再灌注損傷Fas/Fasl、P53蛋白表達的影響及意義[J]. 世界科學技術:中醫藥現代化, 2011, 13(5):888-893.

[6]敖其爾, 烏仁圖雅. 蒙藥珍寶丸對視網膜缺血再灌注損傷中的影響及ICAM-1,Caspase-3的表達[J]. 中國民族醫藥雜志, 2016, 22(10):59-61.