PCR-DGGE技術及其在豬腸道微生物菌群變化的研究進展

侯美如 尹珺伊 王 巖 劉 宇 陳楠楠 秦平偉 馮萬宇 張 艷 史同瑞

（黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006）

動物腸道菌群是一個非常復雜多樣的生物群體。以哺乳動物為例，其腸道微生物分屬400多種不同的微生物，每克大腸內容物的細菌含量高達1010個。這些微生物相互依賴、相互制約，對宿主的健康和物質的營養代謝起著重要的作用。因此，動物腸道菌群的組成及相互作用，和腸道功能的健康有著密切的聯系，但傳統的微生物鑒別方法，是以細菌分離、培養為基礎，進行染色鏡檢，生化鑒定，由于在腸道中90%以上的微生物是嚴格厭氧菌，培養條件苛刻，僅有少數可在實驗室條件下被分離純化，往往不能客觀、真實地反映腸道菌群數量及多樣性[1-2]。

分子生物學的發展及基因庫的不斷完善，為細菌多樣性分析提供了有效的技術手段，如rRNA/rDNA序列分析、隨機擴增多態性分析（RADP）、限制性內切酶酶切片段長度多態性分析（RFLP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）等。這些技術的出現彌補了傳統研究方法的不足，同時提供了一種對微生物群落進行定性描述和定量分析的方法，為研究微生物的種族發育關系提供了科學的分類依據。

變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE），是由Fisher等人1983年創立并用于檢測DNA突變的技術。隨后，Muyzer等人在1993年首次將該技術用于研究土壤的微生物區系，結果證實了該技術在研究微生物菌群分析和多樣性方面的優勢[3]。

1 PCR-DGGE技術的基本原理

在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，雙鏈DNA的分子大小和電荷是影響其遷移行為的主要因素。根據遷移行為的差異，便可對不同大小的DNA片段進行區分，同樣大小的DNA片段由于遷移行為相同，而無法被區分。PCR-DGGE技術在普通聚丙烯酰胺凝膠配方的基礎上，增加了尿素和甲基酰胺，形成變性梯度凝膠。

序列組成不同的雙鏈DNA片段，具有不同的解鏈區域及其不同解鏈區域的解鏈濃度。在DGGE電泳過程中，凝膠濃度呈現梯度變化，變性濃度由低至高，濃度最初比較低，無法達到雙鏈DNA片段最低的解鏈區域而完成解鏈，DNA片段的這段遷移行為與在一般的聚丙烯酰胺凝膠中是一樣的；隨著變性濃度的變化，當DNA片段到達一個特定的濃度位置，變性濃度滿足雙鏈DNA片段最低的解鏈區域解鏈時，DNA片段便發生解鏈。

由于DNA片段發生部分解鏈，其在凝膠中的遷移速率急劇下降。因此，序列不同而長度相同的DNA片段將在各自特定的凝膠濃度位置上發生解鏈行為，根據它們在凝膠的不同位置而被分開。

當DNA片段在其最高解鏈區域的變性濃度時，將完全解鏈成單鏈分子，它們將在凝膠中繼續遷移。當同等長度、不同序列的DNA片段的差異序列存在于最高的解鏈區域時，便無法將它們區別開來。GC片段夾子的引入，使最高解鏈區域轉為GC夾子處，而GC夾子的解鏈變性濃度很高，從而避免了DNA分子被完全解鏈為單鏈分子的問題，使存在差異序列的DNA片段基本上都能被區分開來。

2 DGGE在豬腸道微生物菌群變化的研究應用

2.1 不同時間點胃腸道菌群變化

Simpson等[4]首次運用PCR-DGGE技術分析豬腸道微生物菌群，研究隨著豬年齡和日糧的變化，不同個體的腸道及糞樣微生物菌群的結構差異。從圖譜上發現，在斷奶前后及育肥期，豬腸道微生物菌群存在差異，都具有特殊條帶，且斷奶對豬腸道細菌種群影響較大。

朱偉云等[5]對12頭仔豬從斷奶第1天開始采集糞樣，采用DGGE技術對糞樣中的細菌菌群變化進行跟蹤，結果顯示，仔豬斷奶后糞樣中的細菌群落迅速發生了復雜的變化，相似度分析也證實了斷奶第1天和斷奶后第13天糞樣細菌群落發生很大變化。一些在仔豬斷奶后第1天出現的優勢條帶在斷奶后第6天消失，很多條帶于斷奶后第13天消失，與此同時，在斷奶后第6、7或13天一些新的條帶陸續出現，隨時間延長，條帶的數量逐漸增多。

Janczyk等運用DGGE技術對仔豬回腸食糜樣品進行分析，在斷奶后1～2天出現唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）條帶，在斷奶后第1天和第11天出現卷曲乳桿菌（Lactobacillu scrispatus）所對應的條帶，Lactobacillus sobrius為所有動物的DGGE圖譜中最優勢條帶的相似菌。

2.2 不同位置內容物菌群的變化

Simpson等[6]采集1頭5月齡仔豬不同腸道位置的內容物及其黏膜樣本，經DGGE圖譜分析，除盲腸外，其他位于同一腸段的內容物及其黏膜處具有相近的圖譜，不同腸道位置的圖譜存在較大差異，位置相距越遠，之間的相似性指數就越小，由此可以發現不同部位腸道菌群分布存在差異，解剖結構相距越遠，菌群相似度越低。

吳高鋒[7]應用PCR-DGGE技術對兩窩（A、B兩組）共16頭不同時間段的健康仔豬不同腸段（十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸）位置中的微生物菌群結構多樣性及其動態變化進行了研究，發現出生后數小時的仔豬（未吃初乳）腸道便有少量細菌定植，隨著日齡的逐漸增長，仔豬不同腸段中的細菌種類及數量也隨之增多。3日齡仔豬腸道就已經存在了相當豐富的細菌種類及數量。腸道中細菌種類及數量到9日齡、15日齡時變化逐漸變緩，20日齡有所增加，但28日齡又有所下降，35日齡逐漸趨于穩定。在各腸段中，十二直腸及空腸的細菌種類和數量是相對較少的，以盲腸及結腸為最多。

2.3 外源添加物對胃腸道內容物細菌群落的影響

Collier等[8]于2003年運用PCR-DGGE技術研究日糧添加抗菌素對豬回腸微生物區系的影響。抗菌素的添加可有效抑制腸道中部分細菌的生長，減少了因腸道免疫應答而引起的營養物質和能量的消耗。從圖譜中亦可以看出，添加抗菌素組的腸道細菌條帶數量和總DNA濃度減少。同時，在添加抗菌素的過程中，豬腸道中的細菌總數明顯降低，而乳酸菌的數量明顯增加，進一步證明抗菌素可以明顯促進豬只生長。

Konstantinov等[9]運用DGGE技術研究甜菜渣和果寡糖等可發酵碳水化合物對仔豬糞樣菌群多樣性的影響，結果表明，飼喂組與對照組相比，仔豬糞樣中菌群多樣性增加，并且其細菌區系也較快達到穩定。經分析DGGE圖譜中的13條優勢條帶與Clostridium coccoides和Clostridium leptum的相似度為91%～97%，由此推測，這些細菌可能在仔豬利用日糧纖維上起了作用。同樣朱偉云等的研究[5]對3窩12頭仔豬分別飼喂3種不同的日糧，以基本日糧配果寡糖及甜菜汁的b組，在斷奶第1周內仔豬糞樣中的細菌群落發生急劇變化而后緩慢變化，其推測可能與其日糧中果寡糖有關。

Wang[10]等運用DGGE技術研究飼喂全株水稻后豬結腸內容物和糞樣中菌群的組成，發現飼喂全株水稻日糧的豬糞樣樣品的DGGE圖譜條帶數量和Shannon多樣性指數顯著增加，但隨著日糧中全株水稻比例的增加，其結腸內容物樣品的DGGE條帶數量和多樣性指數卻逐漸較少。

針對豬場中采用“早期補飼、早期斷奶”的飼養模式而引起的仔豬腹瀉問題，姚文等[11]利用PCR-DGGE結合16S rDNA序列技術，通過研究該飼喂模式下仔豬腸道中微生物種群的動態變化情況，科學闡明了微生物變化與仔豬腹瀉的關系。研究表明，仔豬飼喂開食料前，腸道微生物的優勢譜帶為單一的大腸桿菌；飼喂開食料后，仔豬腸道微生物區系變得復雜且多樣，但這種變化較為短暫，導致仔豬呈現短期腹瀉的癥狀。斷奶后仔豬腸道微生物圖譜多樣性指數穩定，穩定的微生物區系多樣性可緩解斷奶后仔豬應激產生的腹瀉癥狀，隨著仔豬日齡的增長，腸道中微生物區系組成也逐漸穩定。

3 展望

PCR-DGGE技術在微生物區系分析中，具有較大的優勢，無需進行微生物培養，打破了不可培養微生物的限制。在自然界中尚不可培養的微生物占比85%～99%，而一些可培養的微生物對生長環境要求較為苛刻，給多態性和動態分析帶來了限制。DGGE技術還可以與其他方法結合，如傳統培養技術、克隆測序技術、雜交技術、實時熒光定量PCR技術，更加全面系統地展示微生態菌落的構成及優勢菌群的分析，更加真實地反映微生物群落結構和功能的本質。

[1]Zoetendal EG,Collier CT,Koike S,et al.Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota:a review[J].Journal of Nutrition,2004,134(2):465-472.

[2]Savage DC.Microbial ecology of the gastrointestinal tract[J].Annual Review of Microbiology,1977,31(31):107-133.

[4]Mccracken VJ,Simpson JM,Mackie RI,et al.Molecular ecological analysis of dietary and antibiotic-induced alterations of the mouse intestinal microbiota[J].Journal of Nutrition,2001,131(6):1862-1870.

[5]朱偉云,姚文,毛勝勇.變性梯度凝膠電泳法研究斷奶仔豬糞樣細菌區系變化[J].微生物學報,2003,43(4):503-508.

[6]Simpson JM,Mccracken VJ,White BA,et al.Application of denaturant gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiota[J].Journal of Microbiological Methods,1999,36(3):167-179.

[7]吳高鋒.應用PCR-DGGE技術對不同日齡仔豬腸道菌群分布規律的研究[D].鄭州:河南農業大學,2009.

[8]Cocolin L,Manzano M,Cantoni C,et al.Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of the 16S rRNA gene V1 region to monitor dynamic changes in the bacterial popularion during fermentation ofItalian sausages [J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(11):5113-5121.

[9]Konatantinov SR,Zhu WY,Willians B A,et al.Effect of fermentable carbohydrates on piglet fecal bacterial communites as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA[J].FEMS Microbiology Ecology,2003,43:225-235.

[10]Wang HF,Zhu WY,Yao W,et al.DGGE and 16S rDNA sequencing analysis of bacterial communities in colon content and feces of pigs fed whole crop rice[J].Anaerobe,2007,13(3):127-133.

[11]姚文,朱偉云,毛勝勇.16S rDNA技術研究新生腹瀉仔豬糞樣細菌區系的多樣性變化[J].微生物學報,2006,46(1):150-154.