人工合成啟動子的應用

肖紅慶 李曉薇 Jameel Aysha 劉偉燦 章婷婷 王一帆 李海燕

（吉林農業大學生命科學學院/生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，吉林 長春130118）

啟動子在基因轉錄的起始和調節中發揮非常重要的作用，在基因工程中是重要的組成構件[1]。天然啟動子很難實現連續的、有目的性的調控。對于組成型啟動子，一般啟動子的序列都比較固定，所以啟動子的活性一般也都無法實現更多的調控。而對于誘導型啟動子，經過誘導物的誘導之后，通過改變濃度可以在一定的范圍內調節啟動子的活性，但超出這個范圍啟動子的活性是不可以調節的。因此，為了獲得更多在不同條件下具有不同強度、不同功能的啟動子，更為精細的調節基因的表達，近年來，人工合成啟動子的研究受到越來越多人的關注。

近年來，生物技術與生物信息學的不斷發展，具有特定功能的調控元件在顯示出巨大的應用潛力[2]。轉錄水平的調控直接影響基因的表達水平，而啟動子是轉錄水平的重要調節者，因此，啟動子是生物學中的重要調控元件之一[3，4]。人工合成啟動子是指按照實踐需求合成一段啟動子序列，人工合成啟動子能夠實現對基因進行更為精細和定量的調控，使調控網絡中各個基因的表達強度實現最佳組合[5]。人工合成啟動子對于植物生物技術、基因治療和生命科學基本原理研究具有重要價值。本文具體闡述了人工合成啟動子工業生產、基因治療及農業上的應用，并且分析了人工合成啟動子的發展趨勢。

1 在工業生產上的應用

合成啟動子可以通過調節代謝途徑生產生物和化學產品，用于工業上大規模的生產過程[6]。在綜合的生物系統中啟動子存在的遺傳不穩定性，是大規模的工業生產中最重要的限制條件[7]。因此，在這些系統中使用合成啟動子有助于基因的低水平表達，可以提高遺傳穩定性，所以在解決這類問題時設計的合成啟動子應該避免重復序列以防止序列重組，另一種解決方法是使用可誘導的啟動子?？傊趶碗s的基因工程中使用合成啟動子技術有利于增加基因的穩定性和提高對調控元件調節效率的控制。例如，在原核生物體內設計表達兩種或者更多的酶基因，突變體在幾代內會連續增加最終導致基因表達的終止，這是因為突變體在幾代內的積累導致基因失活，有研究報道，通過使用不同強度的雙啟動子對N-乙酰葡糖胺合成路徑中Liu 等利用雙啟動子系統對N-乙酰葡糖胺合成路徑中2 個關鍵酶基因的組合進行優化，使其產量提高了32.4%[8]，說明可以利用合成啟動子技術提高某些工業產品的產量。

2 合成啟動子用于基因治療

合成啟動子技術的又一重大應用是在疾病治療上的應用。實際上腫瘤的病毒療法作為潛在的治療方法已經有幾十年的研究歷史，通過產生一類可復制的病毒使其在腫瘤細胞中特異性的復制使腫瘤細胞特異性死亡。有研究報道，應用一個復制的有活性的逆轉錄病毒能夠選擇性殺死腫瘤細胞[9]，其原理在于通過在逆轉錄病毒長末端重復序列上結合前列腺特異啟動子，在前列腺特異啟動子的基礎上設計更多在前列腺癌細胞中有活性的合成啟動子，其結果顯示，逆轉錄病毒只在癌細胞中有效的轉導和復制，這是一個令人關注的治療癌癥的療法。

另外，只在循環內皮細胞有活性的啟動子對于癌癥基因療法是一個重要的治療手段?？梢允鼓繕诵卵茉谀[瘤中生長以切斷供應腫瘤生長的營養，發展一種癌癥基因療法。有研究采用此種方法，cdc6基因的啟動子只在分裂的細胞中有活性，使啟動子與內皮素增強子元件相結合構建一個在內皮細胞中有活性的合成啟動子[10]，在體外4個內皮素元件結合到cdc6啟動子上得到了最優的啟動子。當將其引入體內時，合成啟動子在腫瘤組織中比CMV35S(Cucumber mosaic virus)啟動子具有更高的驅動基因表達的效率。

合成啟動子在基因治療方面的另一個重要應用是構建肝臟特異性啟動子，在轉基因小鼠模型中用來治愈糖尿病[11]。通過隨機組合順式作用元件構建一個在肝細胞中對胰島素敏感的合成啟動子，注射最高劑量病毒的小鼠在50d內未出現高血糖癥狀。注射由CMV啟動子表達胰島素的腺病毒由于血糖過低導致了小鼠的死亡，這說明基因治療中對表達的調節是至關重要的，同時說明設計啟動子時對基因表達的控制是不可忽視的[12]。

3 植物抗逆上的應用

植物中主要是通過在核心啟動子上游組合順式調控元件來構建脅迫誘導型人工合成啟動子。有研究導報利用W1-box、W2-box、GCC-box、JERE等調控元件構建的四聚體構建人工合成啟動子，轉化合成啟動子的轉基因植物在受到病原菌脅迫時報告基因GUS的表達結果說明，在受到不同脅迫誘導時，基因的表達水平和啟動子的可誘導成都均有所不同[13]。同樣通過組合來自小麥的ABRE和來自大麥HVA22的ABRC調控元件，并且與Mini35S啟動子融合構建的合成啟動子，轉化合成啟動子的轉基因煙草在受到高鹽、脫水和脫落酸脅迫時，報告基因GUS的表達水平均有所提高，證明構建的人工合成啟動子對某些逆境脅迫有響應[14]。Liu等人通過組合對于植物防御病原菌有作用的順式調控元件構建人工合成啟動子，通過在轉基因擬南芥和煙草中的功能分析，在轉基因植物手病原菌、水楊酸、乙烯和茉莉酸甲酯等脅迫時，構建的人工合成啟動子能夠提高報告基因的表達水平[15]。

植物中合成啟動子的研究相對較少且大多集中于誘導型合成啟動子，主要利用順式調控元件融合核心啟動子的方法構建。Rushton 等[13]曾利用 W1-box、W2-box、GCC 元件、JERE 元件等組合成多種四聚體人工合成啟動子。不同病原菌處理下的轉基因植株 GUS 分析結果顯示，不同啟動子的誘導因子、本底表達水平和誘導程度均存在明顯差別。通過四拷貝小麥來源的脫落酸應答元件(4×ABRE)或者兩拷貝脫落酸應答元件連接兩拷貝大麥 HVA22 結合元件(2×ABRC)分別與 Mini 35S 融合發現，合成啟動子能夠誘導 GUS報告基因在轉基因煙草中對高鹽、脫水和脫落酸應答表達，證明它們能夠作為一種有效的脅迫誘導啟動子。Koschmann 等人根據 生物信息學分析結果，篩選到PathoPlant 數據庫中的擬南芥芯片數據，挑選出受病原菌誘導上調表達的基因，利用 BEST 軟件尋找這些基因啟動子區的保守序列，然后與 AthaMap、PLACE 和 AGRIS 數據庫中的順式調控元件比對，挑選與已知順式調控元件的相似度低的保守序列，通過合成啟動子的方法驗證[14]。Liu 等人將一些與病原菌和植物防御信號分子誘導相關的順式調控元件與核心啟動子融合并穩定轉化煙草和擬南芥，對轉基因植株進行病原菌、水楊酸、乙烯和茉莉酸甲酯處理，結果證實合成的誘導型啟動子在轉基因煙草和擬南芥中能夠發揮預期功能[15]。

在農業上，惡劣的環境例如干旱、高鹽和低溫等條件對作物的產量和產品質量都有較大的影響[16]，遺傳轉化已經成為一種重要的提高作物抗逆性的手段。合成啟動子包含天然啟動子區域的調控元件DNA序列，并且它們與天然啟動子極大的不同，因為它們可以提供自然界中不存在的表達譜。合成啟動子還可以對啟動子中某部分序列的功能進行分析驗證，合成啟動子可以通過有規律的、有目的的組合順式調控元件來構建，合成啟動子中順式元件的排列可以導致非常精確的轉基因表達，而避免了在“全長”啟動子序列內存在的另外的元件產生的非特異性表達[17，18]。

轉錄因子可以調節許多抗逆基因的表達，而且在調節植物對脅迫的響應方面發揮重要的作用，例如ABA響應元件結合因子/ABA響應元件家族[19]。在某些物種中，在其他脅迫響應基因表達的條件下，基本的DREBs/CBFs基因過表達可以對干旱、高鹽、低溫等脅迫產生抗性[20]。同時AtMYC2和AtMYB2 cDNAs基因的過表達可以提高轉基因植物的抗逆性。然而，在正常條件下轉基因過表達會阻礙植物的生長和大幅度降低作物產量[21，22]。有研究報道在脅迫誘導處理的擬南芥rd29A啟動子的作用下，DREBs/CBFs基因的表達對植物的生長可以產生最小的干擾，可以獲得最優的抗逆植株[23]。并且在很多不同的轉基因植物中也得到了同樣的結論，例如馬鈴薯[24]、番茄、花生[25]、煙草[21]、大米[26]。通過組合抗逆調節序列構建人工合成啟動子，實現了在不同逆境脅迫條件下合成啟動子在植物所有的器官和組織中的響應，并且誘導基因有效的表達。

另外，合成啟動子在早期檢測植物病原體感染方面也有重要的應用價值。在抗病信號傳導途徑中，許多抗病相關基因的啟動子區都包含一系列保守的順式作用元件，它們對植物抗病響應的精確調控發揮著重要作用。隨著對這些順式作用元件功能的了解，可以通過組合這些有功能的元件，產生用于防治植物病害的誘導型啟動子[27]。通過農桿菌浸入法轉染煙草，啟動子在相應的植物激素處理時具有敏感性和可誘導性，通過擬南芥介導的瞬時表達體系證明合成的誘導型啟動子可以對植物病原體的感染進行早期的檢測。在作物防病抗病方面，誘導型啟動子相對于天然啟動子更有優勢和利用價值。

4 展望

合成啟動子在過去超過20a的時間里，在識別天然啟動子重要的結構特點、和調節基因表達方面發揮著重要的作用。近年來，生物信息學的發展和大量實驗方法與實驗儀器的進步，促進了在嚴格的調控下能夠驅動基因有效表達的高特異性啟動子的合成。將來可以設計在病變的細胞、特異組織和感染不同病原體的細胞中有活性的啟動子，在臨床上用于檢測和治療目前無法得到治愈的疾病。隨著生物技術的不斷發展進步，成功的實現了在生物系統中的模擬實驗。有研究報道目前能夠通過[28]利用計算子模型確定了造血干細胞中轉錄調控模式。隨著計算機預測技術在未來的不斷發展，實現對啟動子表達強度的預測將會成為可能。在對啟動子的設計，選擇和利用方面將會更加合理。因此在未來構建具有本底活性低、定向表達、啟動表達快、表達易調節等特點的人工合成啟動子，仍然是將來研究的重點。隨著對人工合成啟動子研究的不斷深入與發展，人工合成啟動子在生物制藥、農業領域和開發新的基因療法等方面將會有更加廣泛的應用前景。

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