影響免疫組化染色質(zhì)量的幾點因素分析

林秀香 林秋月 阮順愛

（福建省莆田市第一醫(yī)院，福建 莆田 351100）

做好免疫組化染色實驗工作的首要前提條件，是進(jìn)行合理的組織處理工作，這項環(huán)節(jié)也是對染色成敗，起到?jīng)Q定性作用的內(nèi)部因素。因此，在準(zhǔn)備組織細(xì)胞的過程中，除了要保證組織細(xì)胞形態(tài)的完整性外，還需要盡可能地確保細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原，避免組織的自溶。判斷染色結(jié)果的前提與基礎(chǔ)條件，在于一張良好的免疫組化染色片，但高質(zhì)量染色片的形成，需要經(jīng)歷多個繁瑣的步驟，且任何一步存在差錯與失誤均會對最終結(jié)果造成影響[1]。因此，本文對在實驗過程中影響免疫組化染色質(zhì)量的因素進(jìn)行如下分析。

1 染色前處理工作

1.1 固定組織：對組織進(jìn)行固定在免疫組化的主要目的，在于盡可能地確保組織細(xì)胞內(nèi)的抗原性，在實驗中通常選擇濃度為10%的緩沖福爾馬林液作為固定液。待組織離體后應(yīng)該在30 min內(nèi)對其立即固定12～24 h。原因在于臨床手術(shù)量大，一般情況下是在標(biāo)本送檢的第2天，才會進(jìn)行取材工作，取材的組織塊，應(yīng)該厚度不超過3 mm，大小為1 cm×1 cm為佳，太厚組織脫水不良，影響組織的結(jié)構(gòu)及表達(dá)，太大則影響切片質(zhì)量又浪費試劑，取材工作完成后，方才利用全自動脫水機(jī)進(jìn)行程序化脫水處理，在此過程中一部分標(biāo)本無法得到充分且及時的固定[2]。鑒于此，為了確保組織得到充分固定，需要對送檢標(biāo)本立刻剖開并足量固定，同時需要注意的是固定液應(yīng)該為組織的10倍以上，主要目的在于防止抗原的丟失以及蛋白質(zhì)的變性。

1.2 制備防脫玻片：實驗人員采用濃度為2%的鹽酸，將未處理過的載玻片進(jìn)行長達(dá)24 h的浸泡，然后將載玻片采用流水，進(jìn)行充分地沖洗，清洗完成后，利用蒸餾水再進(jìn)行2遍沖洗。再將載玻片放置在，濃度為95%的乙醇中進(jìn)行長達(dá)2 h的浸泡，浸泡完成后放入干燥箱進(jìn)行烘干操作，直至載玻片完全冷卻后采用經(jīng)丙酮稀釋的APES工作液進(jìn)行30 s的浸泡，最后將其取出自然晾干便可。

1.3 切片及烤片：由于實驗過程步驟繁瑣以及時間長，同時在抗原修復(fù)的過程中需要將其加熱至95 ℃以上，盡管對組織進(jìn)行充分固定，也難以確保其在實驗中不出現(xiàn)破損、邊緣卷起、脫落以及不完整等狀況。為了解決這一問題，就需要對組織進(jìn)行前期處理工作，從嚴(yán)格規(guī)范取材，到包埋結(jié)束過程中的每個步驟，，同時合理地控制固定、脫水、浸蠟、包埋等各個步驟的溫度與時間，因為過高的脫水、浸蠟、包埋的溫度和過長的脫水、浸蠟、包埋的時間，均可能會造成抗原的滅活，最終影響免疫染色的表達(dá)了。經(jīng)過處理后便能得到一塊優(yōu)質(zhì)的蠟塊，確保切片的厚度在4 μm為佳，切片過薄則影響表達(dá)，過厚則影響強度評判，也容易脫片，由于切片若存在氣泡、刀痕以及皺褶等狀況，則在相應(yīng)部位，可能會伴有非特異性著色現(xiàn)象[3]。因而在切片的過程中需要采用鋒利無痕的刀具，實驗人員需要具備嫻熟切片手法，確保切片的均勻性與完整性。除此之外，在同一例患者的免疫組化片，要求所有的組織片撈在載玻片上的方向，與HE染色的組織片方向是一致的，這是為了我們在觀察免疫組化切片時，便于與HE染色的組織作對照，有利于快速找到需要觀察的免疫組化表達(dá)部位，若是同1例患者免疫組化切片撈在載波片上的朝向各不相同，看每一張切片病理醫(yī)師就得調(diào)整一下顯微鏡，來尋找需要對比診斷的位置，那將延長醫(yī)師的看片時間，增加不必要的勞動力。為了保證切片撈到載玻片的位置，與HE切片的位置一置，我們可以在蠟塊的石蠟部位用小鑷子劃個溝，確認(rèn)溝的位置在HE切片的上下左右的哪個方向，我們就在撈片時讓溝朝向那個方向，這樣避免在撈片時，因朝向不清楚，而造成組織在載玻片上的方向不同。切片需要在溫度在60～65 ℃的烤箱內(nèi)進(jìn)行長達(dá)1～2 h的烤片，或者溫度在58～60 ℃的烤箱中過夜，可根據(jù)外界溫度和實驗室條件適當(dāng)選擇烤片時間和方式，需要注意的是烤片溫度不得過高，原因在于切片在高溫干燥的條件下會加速其組織中的抗原氧化，使其滅活，從而影響染色質(zhì)量。

1.4 抗原修復(fù)：在運用中性甲醛緩沖液來固定組織或細(xì)胞的過程中，在組織和細(xì)胞中的許多分子內(nèi)以及分子間形成了醛基鍵，造成一部分的組織抗原決定簇被封閉，造成大部分的抗原無法與抗體進(jìn)行很好的反應(yīng)，因此免疫組化染色的另一個關(guān)鍵，在于進(jìn)行抗原修復(fù)工作。現(xiàn)階段，對于抗原修復(fù)的通常采取兩種方式，包括酶消化與熱修復(fù)，其中酶消化包括胰酶以及胃酶兩種消化形式，熱修復(fù)則常用高溫水浴、微波加熱以及高壓3種方法。其中在臨床上應(yīng)用最為廣泛的為高壓法，主要原因是在于其操作方法容易掌握，簡單易行；而熱修復(fù)主要用于大多數(shù)的抗原工作，尤其在核抗原中得到廣泛應(yīng)用[4]。通常情況下，抗原修復(fù)液采用的是劑量為0.1 mol/L的檸檬酸或pH值為6.0的檸檬酸鹽液；胃酶消化則適用于細(xì)胞間抗原；胰酶消化主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原。除此之外，抗原修復(fù)方法還包括雙暴露法，也就是熱修復(fù)聯(lián)合酶消化方式，比如高壓修復(fù)+胃酶法，或是高壓修復(fù)+胰酶法，總之用雙暴露法修復(fù)抗原，胃酶和胰酶的消化時間應(yīng)相應(yīng)縮短，具體須縮短的時間，根據(jù)各室間質(zhì)控的結(jié)果調(diào)整。總而言之，為了確保染色質(zhì)量，需要實驗人員在修復(fù)工作中，嚴(yán)格按照抗體說明書的相關(guān)要求進(jìn)行。

2 染色處理中各個環(huán)節(jié)

由于在整個免疫組化染色實驗的過程中，具有過程長以及步驟繁瑣等特點，因此，在實驗各個環(huán)節(jié)中，均應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)的要求進(jìn)行操作。例如在脫蠟的過程中需要確保具有充分的時間，徹底脫蠟，當(dāng)實驗過程中室溫過低時，應(yīng)該提前在溫箱中加熱二甲苯，為了能夠充分脫苯，脫苯采用的酒精也需要加熱，在此過程中其他的染色步驟中所采用的試劑也需要做相應(yīng)的處理[5]。這就是說當(dāng)實驗室的室溫過低時，應(yīng)該盡可能地利用熱臺以及水浴箱等提高試劑溫度，避免染色的失敗。同時每一步都應(yīng)用pH值為7.3左右的PBS液充分沖洗，沖洗的間隔時間與次數(shù)不得省略，主要原因在于PBS液中含有鹽，其能夠在一定程度上減少背景染色。具體各個環(huán)節(jié)應(yīng)該注意的事項如下：

2.1 抗體與孵育環(huán)境：抗體的主要構(gòu)成要素包括蛋白質(zhì)，要是沒有對抗體進(jìn)行有效的存儲（如存儲抗體的溫濕度等）或是存儲使用不當(dāng)，萬一試劑變質(zhì)，必然造成免疫組化染色結(jié)果，出現(xiàn)非特異性背景或假陰性。相關(guān)研究資料通過對抗體保存條件進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，即用型的抗體在37 ℃的環(huán)境下其穩(wěn)定性可以保持180 d，若放置在4 ℃的冷藏條件下，抗體則可以存放14個月仍然保持其穩(wěn)定性[6]。若在實驗的過程中采用的是濃縮型的抗體，則在實驗的應(yīng)用前，應(yīng)該在實驗室內(nèi)進(jìn)行成倍數(shù)實驗，以確保能夠找到最佳的稀釋濃度。通常情況下，對于抗體的孵育時間，為一抗室溫進(jìn)行1 h的孵育，二抗室溫進(jìn)行15 min的孵育。除此之外，抗體在孵育的過程中，應(yīng)該確保周圍環(huán)境的潮濕封閉，防止孵育盒中，組織切片上之抗體試劑因水分蒸發(fā)而導(dǎo)致抗體的濃縮干燥，最終出現(xiàn)背景染色的不良狀況。

2.2 顯色反應(yīng)：由于在各實驗過程中所采用的標(biāo)本與組織來源各不相同，同時其抗原的含量也不等，因而這就要求在鏡下觀察切片顯色，并對顯色的時間進(jìn)行合理控制。在觀察顯色反應(yīng)前可以先觀察蘇木精-伊紅切片，主要目的在于對基本病變與抗體定位特點進(jìn)行熟悉與了解，以排除假陽性著色的干擾，對切片中病變位置進(jìn)行準(zhǔn)確找出。在滴加顯色劑的過程中一次不得加的過多，避免顯色過度；并對本次試驗的組織切片，顯色快并且著色強的抗體，在顯色達(dá)三分鐘時，終止顯色，置于鏡下觀察，判斷顯色程度是否合適，以確定是否繼續(xù)顯色，以避免過度顯色，影響陽性表達(dá)的分級評判，而造成誤判。如HER-2若是過度顯色，+++和++就難以區(qū)分，患者就得去做基因檢測來確診了，浪費金錢和時間。對于顯色較慢或是陰性的抗體，按說明書上的要求放置5～10 min后終止顯色，不可因為是弱陽性及陰性而延長放置時間，造成假陽性表達(dá)。總而言之，嚴(yán)格控制顯色程度，對陽性的判斷及患者的治療及預(yù)后皆有密切聯(lián)系。

基于上述的諸多因素，造成了免疫組化染色的操作步驟繁多并且過程長，因而對染色質(zhì)量造成影響的環(huán)節(jié)較多，任何一個步驟出現(xiàn)問題與缺陷均會對染色成敗造成直接或間接影響。因此，這就要求相關(guān)人員須持證上崗，在實驗過程中，須具備較強的責(zé)任心，嚴(yán)格按照相關(guān)的實驗室規(guī)范流程進(jìn)行，做好室間質(zhì)控，以及陰陽對照，確保染色質(zhì)量的準(zhǔn)確性，為病理的優(yōu)質(zhì)診斷保駕，護(hù)航。