紫外-可見(UV-Vis)光譜法在中藥質量控制中的應用

1. 天津中醫藥大學中藥制藥工程學院，天津 300193；2. 浙江大學藥物信息學研究所，浙江 杭州 310058

紫外可見光譜(Ultraviolet-visible spectroscopy, UV-Vis)是指波長范圍在200～760 nm之間的波段，該波段屬于電子光譜，是由于價電子的躍遷而產生的吸收光譜。利用物質的分子或離子對紫外和可見光的吸收所產生的UV-Vis光譜及吸收程度可以對物質的組成、含量及結構進行分析、測定和推斷。UV-Vis光譜用于具有紫外、可見光吸收物質的檢測，靈敏度高，特征性好，在中藥質量控制得到了廣泛的應用。本文對UV-Vis光譜法在中藥質量控制中的應用進行綜述，并對其應用前景進行展望，以期為相關領域的研究提供參考。

1 比色法測定多種大類物質的含量

比色法(colorimetry)是通過比較或測量有色物質溶液顏色深度，并根據朗伯比爾定律確定待測組分濃度或含量的方法。常用的檢測波段是UV-Vis波段，雖然該方法是一種歷史悠久的傳統分析方法，但目前在中藥質量控制領域仍被廣泛應用。

蘇玉順等[1]對UV-Vis光譜法測定植物多糖含量過程中的顯色劑選取、測定條件的優化以及具體應用進行了分析，具有較好的參考價值。古炳明等[2]采用UV-Vis分光光度法建立了巴豆中可溶性蛋白含量的測定方法，檢測波長為593 nm，巴豆中可溶性蛋白在0.010 3～0.103 0 mg/ml范圍內線性關系良好,平均回收率為98.37%，RSD為1.01%，該方法簡單、方便、專屬性強，可為其質量評價提供理論依據。石婷婷等[3]采用UV-Vis方法考察了不同廠家腦得生片物質組釋放特征，以UV-Vis法測定并計算各供試品溶液的物質組濃度及釋放度，并采用Weilbull分布進行曲線擬合，考察了不同釋放度測定裝置、不同釋放介質和不同攪拌槳轉速對腦得生片物質組釋放度的影響，并測定了不同廠家腦得生片物質組釋放度。楊連菊等[4]采用UV-Vis測定了馬應龍痔瘡膏中氧化鋅的含量，研究采用鋅試劑顯色的方法，以標準曲線法計算含量，結果表明，該方法與絡合滴定法相比，準確、靈敏度高，適用于測定爐甘石藥材及飲片中氧化鋅的含量。

采用比色法進行大類物質測定時，有些可以直接利用待測物質特征結構對于UV-Vis波段的吸收進行測定，有些則需要先采用顯色劑與待測物質結合、反應，從而產生UV-Vis波段的吸收，然后再進行測定。采用前一種方式，往往待測中藥體系中其他雜質會對測定造成較大干擾，影響方法的選擇性；而采用顯色法，往往又因為操作過程復雜，顯色條件難以準確控制等原因，導致方法的穩定性較差。另外，采用比色法測定大類物質含量，往往是選擇一種標準物質制作標準曲線，所測含量為這種標準物質的折合含量，因此，采用不同標準物質測得的大類成分含量不具有可比性。

2 作為高效液相色譜(HPLC)分析方法的檢測器

目前，高效液相色譜(HPLC)法最為常用的檢測器是UV或DAD檢測器，它是利用特定化合物在UV波段的特征吸收值與一定濃度之間的線性關系，對特定物質進行含量測定的。一般而言，對于含有共軛雙鍵或苯環結構的化合物，其特征吸收明顯，可選擇其特征吸收波長作為檢測波長，對于末端吸收或無明顯特征吸收的化合物，可利用末端的非特征吸收波長，或者通過對目標成分進行衍生化處理，使其具有特征吸收，從而進行檢測。非特征吸收檢測波長，一般靈敏度、選擇性稍差，衍生化處理則復雜耗時、經常使用有毒性的衍生化試劑，對于這類成分而言，UV并非上選，推薦使用其他類型的檢測器，比如蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器和質譜檢測器等。

周惠芬等[5]以蘆丁為對照品，檢測波長272 nm，建立了UV-Vis整體考察補陽還五湯總黃酮含量方法，并采用HPLC方法同時檢測了補陽還五湯總黃酮中毛蕊異黃酮、芒柄花素、羥基紅花黃色素A的含量。結果表明，所建方法簡單便捷，重現性好，有利于補陽還五湯中總黃酮的質量控制。該課題組還采用類似的方法對養陰通腦顆粒有效部位的質量控制[6]。值得注意的是，用于測定總黃酮的含量，需要進行較為復雜的前處理，而采用HPLC測定多種黃酮類物質，前處理則相對簡單，而且黃酮類物質具有較好的紫外吸收特性，便于進行直接測定。黃翔等[7]建立同時測定丹紅注射液中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A含量的高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)方法，結果表明，樣品中6種成分分離良好，線性關系良好，該方法操作簡單，結果準確，具有較好的重復性和穩定性，可為丹紅注射液的質量控制提供參考。

對于氨基酸、糖、膽酸等UV-Vis波段無特征吸收的化合物，常采用柱前衍生化的方法進行預處理。陳萍紅等[8]采用RP-HPLC法同時測定阿膠中13種氨基酸的量。該方法將阿膠以6 mol/L鹽酸于120℃水解3 h，以異硫氰酸苯酯柱前衍生，用反相高效液相色譜法測定氨基酸的量。檢測波長為254 nm。結果在36 min內可完成對阿膠中13種氨基酸的分離測定，各氨基酸的峰面積與濃度的線性關系良好，加樣回收率為95.2%～104.4%，RSD<5.0%。方法準確，重復性好，可用于阿膠的質量控制，亦可為其他藥物中氨基酸的分析提供參考。楊歡等[9]建立了柱前衍生HPLC-UV同時測定人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸的含量。方法以2-萘基溴甲基酮為衍生試劑，三乙胺為催化劑，60℃水浴條件下對膽酸及豬去氧膽酸進行衍生，考察衍生試劑用量、催化劑用量及反應時間等對衍生產物的影響，確定衍生反應的條件，然后考察建立HPLC-UV分離檢測方法對人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸含量進行測定。結果表明，當衍生試劑的摩爾量與膽酸及豬去氧膽酸的摩爾總量的比大于30∶1，催化劑的摩爾量與兩者的摩爾總量的比在5∶1～60∶1范圍內，在60℃水浴條件下反應50 min時，膽酸及豬去氧膽酸的衍生物反應完全。膽酸在0.4～5.0 μg范圍內線性關系良好(r=0.999 5)；豬去氧膽酸在0.12～1.5 μg范圍內線性關系良好(r=0.999 8)。膽酸的平均回收率(n=6)為100%，RSD為2.40%；豬去氧膽酸的平均回收率(n=6)為101%，RSD為1.33%。該方法靈敏度高、準確可靠、穩定性和重復性好，可用于測定人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸的含量。類似的工作還有很多[10-11]。當然，也可采用末端吸收進行直接測定，彭波等[12]建立了RP-HPLC法測定熊去氧膽酸片中熊去氧膽酸含量的方法，該方法直接使用205nm為檢測波長，結果表明熊去氧膽酸片中熊去氧膽酸及有關物質在測定范圍內線性關系良好。測試方法精密度、穩定性、重現性尚可，平均回收率為98.5%～100.4%，將該方法應用于熊去氧膽酸中熊去氧膽酸及相關物質含量的測定具有簡便、靈敏度高、準確性強的優勢，能有效控制熊去氧膽酸片的質量。

3 紫外可見光譜與化學計量學技術的結合使用

將紫外光譜與化學計量學相結合，對全波段的紫外吸收光譜進行多變量數據分析，此方法已被廣泛應用于制藥行業的化學反應監測、食品品質鑒別及含量測定等領域[13-16]，可借鑒用于中藥質量控制。常用的化學計量學方法方法包括多元線性回歸(MLR)、主成分回歸(PCR)、PLSR、多元曲線分辨(MCR)，以及聚類、判別分析方法等等。

吳柄樺等[17]研究紫外-可見-短波近紅外漫反射光纖光譜技術結合化學計量學應用于鑒別白芷、葛根、當歸、白術、白芍五種外觀相似的中藥材的可行性，對制樣方法、光譜獲取、特征信息提取、光譜預處理、數學模型的建立進行優化，旨在建立一種簡便、快速鑒別中藥材的方法，為中藥材質量控制提供有價值的參考。朱向榮等[18]采用支持向量機對清開靈注射液六混中間體的UV光譜進行分析，實現了對4個批次的中藥清開靈注射液六混中間體以及其混和批次共147個樣本的鑒別。區曉云等[19]將UV光譜用于監測陳皮中橙皮苷的提取工藝研究，可對煎煮過程中橙皮苷的溶出濃度進行動態監測。孟慶華等[20]研究了UV光譜相似度在中藥注射液質量控制中的應用，采用UV吸收光譜上所有數據點計算樣品紫外光譜與多個對照品的光譜相似度，可以靈敏地反映譜圖間的差異，通過與閾值的比較對樣品質量進行評價，UV光譜相似度法可作為中藥注射液質量控制的一種定性分析方法。邢麗紅等[21]建立應用紫外光譜快速測定金銀花提取物中5種有機酸含量的方法，該方法以HPLC法為參照，測定金銀花提取物中綠原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸等5種有機酸類成分的含量。在220-400 nm范圍內掃描金銀花提取物溶液的紫外吸收光譜,采用偏最小二乘回歸(PLSR)法分別建立樣品紫外吸收光譜與5種有機酸含量之間的校正模型，并對模型的預測能力進行考察。結果表明，5個校正模型對預測集樣本的預測值與對照值的相關系數都在0.90以上，相對預測誤差較小，預測結果準確，該方法操作簡便、快速準確，可作為金銀花提取物中有機酸含量測定的一種快速分析方法。鄭辛甜等[22]建立了一種在線UV光譜采集系統，用于實時記錄反應過程光譜，并采用MCR-ALS方法辨析化學變化信息，獲取反應體系中目標組分的定性和定量信息。將上述方法應用于丹酚酸B、丹酚酸A 和黃芩苷的降解和轉化過程，初步定量闡釋了上述3種中藥化學成份的降解規律。

4 結論

雖然目前各種光譜技術及其他色譜檢測技術不斷涌現，但UV-Vis波段作為一種選擇性強、可解釋程度高、與目標成分線性關系明確的檢測技術，仍有廣泛的應用前景。但可以預言，UV-Vis光譜檢測將由單波長檢測向多波長檢測，固定波長檢測向全光譜檢測方向發展，而紫外-可見波段所蘊含的豐富的信息，也必將在化學計量學方法的輔助下，得到更為充分的應用。同時，作者認為，衍生化方法也必將因其操作繁瑣、使用毒性試劑、重復性較差等缺點，而被逐步淘汰，因此，對于目前仍需要借助衍生顯色的分析方法，必須盡快尋求新的替代方法。