環狀RNA與心血管疾病的研究進展

劉圍圍綜述，石蓓審校

近幾十年以來，心血管疾病已成為導致全球死亡的主要原因之一[1]，心血管疾病也是當今社會危害人類健康和生命最主要的疾病之一，且其發病率在不斷上升，發病年齡也有所提前。盡管心血管疾病的治療手段在不斷進步，但仍有部分患者遠期獲益較小，因此積極探尋有效的預測及治療的分子靶點對心血管疾病具有重要意義。

1 環狀RNA（circRNA）的發現及其形成機制

越來越多的研究發現遺傳因素和表觀遺傳學因素對心血管疾病的進展有著重要影響。目前，非編碼RNA（ncRNA）已成為研究心血管疾病及相關異常發生發展機制的新熱點，既往普遍認為circRNA表達豐度低，很可能是在剪接中錯誤表達[2]。通過高通量測序和新穎的計算方法說明了他們廣泛大量的存在于真核細胞轉錄組內[3-5]。circRNA是既沒有5’到3’極性也沒有多聚腺苷酸（A）尾的共價閉合環狀結構，其長約100個核苷酸[5]，廣泛多樣地存在于哺乳動物中，尤其是人和小鼠，且具有調控基因表達的作用，在各種細胞進程中扮演重要角色。circRNA最早于20世紀70年代在RNA病毒中發現，隨后，在多種生物中檢測到circRNA，其中，Jeck等[4]在人類成纖維細胞中就檢測了大于25 000多種circRNA，其在真核轉錄組高度表達且在外泌體中含量豐富[6]。circRNA通過非經典剪接方式進行反向剪接形成。2013年，Jeck等[4]提出了circRNA發生的兩種模型，即套索驅動的環化和內含子配對驅動的環化，第一種模型認為pre-RNA 的轉錄過程中由于RNA 發生了部分折疊，拉近了原本非相鄰的外顯子，從而發生了外顯子跳躍，使得被跨越的區域形成了環形RNA 中間體，進一步通過套索剪接形成由外顯子構成的環形RNA 分子。另一種模型認為，位于內含子區域的反向互補序列導致了內含子區域配對介導反向剪接從而形成環形RNA分子。大部分的circRNA是由外顯子序列構成[4]，在不同的物種中具有保守性，同時存在組織及不同發育階段的表達特異性，同時也表明了circRNA是豐富、保守的，在某些情況下，circRNA分子的豐度超過其線性mRNA分子的10倍。與

同源的線性RNA相比，其在活體內高度穩定，尤其是在細胞質中，并且能夠被外泌體分泌[7]，可能是由于降低了核酸外切酶的敏感性，circRNA比線性RNA分子有更長的半衰期[5]。circRNA其主要分布在細胞質中，并在活體內高度穩定表達，由于circRNA對核酸酶不敏感，所以比同源線性RNA 更為穩定，這使得circRNA在作為新型臨床診斷標記物的開發應用以及心血管疾病分子靶向治療上具有明顯優勢。

2 環狀RNA的作用機制

過去一直認為circRNA無蛋白編碼能力，不能通過編碼功能性蛋白質實現其生物學功能。然而，2017-03在Cell Research雜志在線發表了一篇論文，該文介紹了circRNA中m6A修飾，并且該修飾能促進circRNA翻譯，首次證明了circRNA表達多肽的現象[8]。緊接著，又有兩篇circRNA翻譯蛋白的文章發表，一篇發現了circ-ZNF609可以直接翻譯蛋白，而且該蛋白參與肌肉的發生過程[9]，另一篇介紹了在果蠅大腦中發現大量的circRNA翻譯多肽或蛋白的情況[10]。circRNA與長鏈ncRNA（lncRNA）、mRNA一樣，也含有大量的微小RNA（miRNA）結合位點，現較為明確的是circRNA作為競爭性內源RNA（ceRNA），通過堿基互補海綿樣吸附miRNA調控miRNA下游靶基因的表達[11]，從而發揮其作用。1990年，Koopman等[12]在小鼠中發現了最具特征的circRNA，即性別決定基因Sry，它含有miR-138的16個結合位點，能與miR-138海綿樣結合并抑制其活性，使miR-138靶基因水平升高[13]。

2013年，Memczak等[5]發現另一種充當“海綿”的人類circRNA，即小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（Cdr1as/ciRS-7），來源于Cdr1蛋白編碼基因反義轉錄[14]，它含有miR-7的63個結合位點并能夠高強度地與miRNA效應復合物結合[5]，從而抑制miRNA-7的活性。Hansen等[13]的研究也說明了ciRS-7能海綿樣吸附miR-7，并以一種依賴miR-7的方式與argonaute（AGO）蛋白高度結合。Zheng等[2]證明了來源于HIPK3 基因 Exon2 的 circRNA（circHIPK3），可以結合 9種miRNA潛在的18個結合位點，且能夠直接結合miR-124并抑制其活性。

有文獻表明，circRNA同其他RNA一樣，可以與某些RNA結合蛋白相互作用，從而直接調控這些蛋白的功能。比如circRNA通過與磷酸化PolⅡ結合影響基因轉錄[14]，circRNA也能夠與AGO蛋白結合。

3 環狀RNA與心臟疾病

3.1 環狀RNA與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是很多心血管疾病共同的病理基礎，是導致人類死亡的主要原因。環狀的INK4基因座中反義非編碼RNA（circANRIL）在人類血管組織、平滑肌細胞、單核/巨噬細胞都有表達，而這些組織細胞都參與動脈粥樣硬化發生發展的過程。2010年，Holdt等[15]的研究結果給位于INK4基因座上的反義ncRNAANRIL與動脈粥樣硬化有關提供了強有力的證據。也有研究表明circANRIL可能通過調控細胞周期素依賴性激酶4（CDK4）蛋白/可變閱讀框抑制因子（INK4/ARF）的表達參與動脈粥樣硬化發生發展的過程[16]。后來，Holdt等又發現了circANRIL能引起核仁壓力和P53的激活，通過調節在動脈粥樣硬化疾病中起關鍵作用的血管組織和細胞，發揮保護作用。circANRIL和核糖體RNA（rRNA）屬于lncRNA的不同家族，但有序列同源性，都能結合雌激素受體共同調節因子抗體同系物1（PES1），其中circANRIL在動脈粥樣硬化心血管疾病相關的染色體9P21位點轉錄，通過競爭性抑制前核糖體RNA（pre-rRNA）與PES1結合，影響rRNA的生成并誘導核仁壓力，從而調控動脈粥樣硬化形成通路發揮抗動脈粥樣硬化作用。

3.2 環狀RNA與心肌梗死

心肌梗死及其并發癥是社會與醫療保健體系巨大的經濟負擔[17]， 雖然大量研究證實心臟干細胞移植到缺血心臟后可改善心功能[18]，但其治療心肌梗死仍處于初級階段[19]，因而對心肌梗死發生機制的研究和找到更多的治療手段極為重要。2016年，Geng等[20]關于circRNA與心肌梗死的研究說明了小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（Cdr1as）與心肌梗死有關。建立心肌梗死的小鼠模型，發現在心肌細胞中存在Cdr1as/ miR-7a通路，且兩者的水平都是上調的。過表達的Cdr1as能誘導細胞凋亡，Cdr1as與miR-7a結合后降低miR-7a的活性，從而上調miR-7a靶基因多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）和轉錄因子特化蛋白1（SP1），最終加重心肌梗死的發展。其中SP1是轉錄因子特化蛋白/Kruppel樣轉錄因子（SP/KLF）家族中的一員[21]，已被證明在心肌梗死的發生發展中（包括心肌纖維化、凋亡和血管再生）扮演重要角色[22]，PARP也有著相似的功能。然而，miR-7a的過表達可以顯著抑制Cdr1as引起的改變，從而得以保護心肌梗死引起的細胞凋亡。

3.3 環狀RNA與心肌肥厚和心力衰竭

心力衰竭是全世界死亡的主要原因之一，心肌肥厚與增加心力衰竭風險之間有著密切的聯系。通常，心肌肥厚最終會發展成為心力衰竭[11]。眾所周知，影響心功能和參與心肌肥厚的因素有很多，如G蛋白耦聯受體、腎上腺素、血管緊張素等。2007年，Carè等[23]發表了關于miRNA-133調控心肌肥厚的文獻，說明了miRNA參與心肌肥厚的調節，但對miRNA上下游的調節因子尚不是很清楚，調控其上下游調節因子很有可能阻斷心臟發生病理性肥厚的通路，最終抑制心肌肥厚發展成為心力衰竭。2015年，Wang等[11]提出了一種由心臟相關性circRNA（HRCR）、miR-223和細胞凋亡蛋白酶募集域抑制劑（ARC）組成的新的調節心臟肥大和心力衰竭的途徑，為心肌肥厚和心力衰竭的治療提供了一個新靶點。其中，miR-223是心肌肥厚和心力衰竭的內源性調節因子，可以促進心肌細胞肥大。ARC是miR-223下游的靶基因，對病理性心肌肥厚和心力衰竭具有保護作用，由于miR-223能特異性調控ARC，還是會引起心臟的肥大或衰竭。然而，HRCR作為miR-223的內源性因子直接結合miR-223并抑制其活性，使miR-223對ARC的調控作用減弱， ARC的表達增加，最終達到保護心臟的作用。

3.4 環狀RNA與心肌纖維化

心肌纖維化是指間質性心肌膠原網絡中的多種定量和定性變化，這些變化是針對心臟缺血性損傷，全身疾病，藥物或影響循環系統或心臟本身的任何其他有害刺激而發生的。心肌纖維化改變心肌的結構，促進心臟功能障礙的發展，也誘發心律失常，影響心力衰竭患者的臨床過程和結果[24]。已有文獻報道，circRNA-010567是miR-141的內源性競爭性ceRNA，可抑制miR-141的表達，后者又可通過內皮細胞細胞間黏附分子-1的表達減輕心肌缺血再灌注損傷[25]。而在2017年，Zhou等[26]發現circRNA-010567能促進心肌的纖維化。該團隊先利用芯片法分析了糖尿病db/db小鼠模型的心肌中環狀RNA，發現circRNA-010567在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）處理的心肌和心臟成纖維細胞中是顯著上調的。然后信息學分析發現circRNA-010567可競爭性地結合miR-141，并通過熒光素酶報告基因試驗確定了這一預測結果。敲除circRNA-010567后，miR-141升高，轉化生長因子β1（TGF-β1）下調，從而抑制纖維化相關蛋白ColⅠ、colⅡ和α-SMA的表達。總之，circRNA-010567通過miR-141/TGF-β1軸促進纖維相關蛋白的表達，進而促進心肌纖維化的這一發現為circRNA在心血管疾病中的研究又提供了新的視野。

3.5 環狀RNA與心臟衰老

衰老是身體機能的逐漸退化，可以分為生理性衰老和病理性衰老，可以發生在細胞水平或有機體水平[27]。Du等[28]在2015年的研究發現形成于叉形頭轉錄因子家族中Foxo3的circRNA即circ-Foxo3是通過調節與壓力、衰老相關的多重因素促進心臟的衰老。circ-Foxo3在心臟組織中高度表達并且主要分布在細胞質中，在胞質內過表達的circ-Foxo3與抗衰老蛋白DNA結合抑制蛋白-1（ID-1）、轉錄因子E2F-1（轉錄因子E2F1是由人類E2F1基因編碼的蛋白質，屬于轉錄因子的一種，該蛋白質具有額外的周期蛋白結合結構域）、抗壓力蛋白黏著斑激酶（FAK）和缺氧誘導因子1-α（HIF1-α）相互作用，降低這些抗衰老蛋白在胞質中的水平，從而影響它們參與的壓力和衰老反應相關通路的調控，最終引起衰老。其中ID-1、E2F1和HIF1-α都是轉錄因子，正常情況下進入細胞核發揮作用。

4 展望

隨著研究者們不斷對circRNA的深度研究，才逐漸對circRNA的形成機制、類型、特征和生物學功能得到認識。雖然circRNA的發現已有幾十年了，并且在多種人類疾病的發生發展過程中發揮著至關重要的作用，但對其在疾病中的作用機制還需要更進一步的探索。已有研究表明circRNA作為中樞神經系統障礙潛在的臨床生物標記物，加上circRNA比線性RNA更為穩定[6]，因此，circRNA有望成為診斷疾病和判斷預后的生物學標志，這就可能為人們提供疾病治療的新靶點。今年，Zhao等[29]研究團隊發現冠心病患者外周血中circRNA表達譜與冠脈正常的患者存在顯著差異，其中以has-circ-0124644表達變化最明顯，被認為是冠心病的分子標記。此外，由于circRNA對核酸酶高度耐受且比線性RNA穩定，那么在胞漿中富集的circRNA是怎樣清除的呢？近來，Lasda等[30]提出了一種可能，即細胞可以通過胞外囊泡的釋放來清除circRNA從而降解它們，并在研究中證實了這一可能。有文獻報告，circRNA含有豐富的miRNA應答元件（MREs），能夠與AGO蛋白結合形成RNA誘導沉默復合體（RISC）的催化核心，最終導致circRNA的降解。也可能存在其他降解circRNA的機制，可能是涉及其他囊泡的相互交換，亦可能是由核酸內切酶清除[30]，因此探索與發現circRNA與外泌體的相關性研究在未來顯得尤為重要。盡管circRNA有其獨特的性質及特點，在心血管疾病中具有重要作用，但目前有關研究仍處于起步階段，探索與發現更多circRNA的作用機制及調控網絡顯得任重而道遠。

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