藥物非臨床安全性評價中腎毒性指標的分析

寧 娜，朱飛鵬，王和枚，賀學林，3，韓 玲

（1.國家食品藥品監督管理總局藥品審評中心，北京 100038；2.北京昭衍新藥研究中心股份有限公司，北京 100176；3.浙江大學附屬第一醫院，浙江杭州 310003）

腎是藥物或其毒性代謝產物富集、排泄的重要器官。近年來，因疾病譜復雜化、聯合用藥等，藥源性腎毒性已成為導致急性腎損傷的重要原因之一［1］。據有關研究報道，全球進入非臨床研究階段的候選化合物只有7%因腎毒性而中止［2］，非臨床研究的腎毒性評價可能被低估。非臨床安全性評價中，可提示腎毒性風險的常規指標包括尿量、尿蛋白、血清肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和組織病理學觀察結果等，如何對異常指標進行深入評價是新藥非臨床研究及后續臨床試驗中需要重點考慮的問題。本文對非臨床腎毒性指標及其評價思路進行綜述，為臨床試驗中風險點的設置提供參考。

1 腎毒性指標異常與藥物的相關性

在非臨床安全性評價中，直接或間接反映腎損傷的檢查項目主要包括針對尿液和血液的臨床病理學檢查，以及針對腎的大體解剖和組織病理學檢查。臨床病理學檢查中，尿檢的主要指標包括尿量、尿蛋白、尿潛血、尿糖和酸堿度；血液學指標包括紅細胞系數（紅細胞、血紅蛋白和紅細胞比容）及相關網織紅細胞計數等；血生化指標包括Cr、BUN、尿酸和電解質含量（如磷、鈣和鉀）等，可從不同的角度反映腎功能減退的程度和持續的時間。而腎的組織病理學病變一般先于臨床病理學指標出現［2］，動物實驗時，通過實驗室常規染色法（如蘇木精-伊紅染色等），可觀察大部分的病理變化，如空泡變、色素沉積、細胞壞死和炎癥細胞浸潤等。

非臨床安全性評價應綜合考慮多個指標的相互印證，判斷其與藥物的相關性。如某案例中，給藥后雄性大鼠出現尿蛋白陽性，組織病理學檢查可見腎近端小管上皮內存在輕度玻璃樣小滴和散在的透明管型等病理改變。由于不良反應的嚴重程度存在性別差異，研究者初步推斷可能與雄性大鼠特有的α2u球蛋白腎病有關。α2u球蛋白是正常大鼠肝合成的一種小分子蛋白質，經腎小球濾過，約50%在近端小管重吸收，溶酶體降解。α2u球蛋白腎病具有性別和物種特異性，只發生于雄性大鼠。外源性物質如與α2u球蛋白發生可逆性結合，可降低溶酶體蛋白酶的降解能力，導致其在溶酶體內蓄積，使溶酶體數量增加、體積增大，從而在近端小管S2段形成特征性的玻璃樣小滴蓄積，進而發生單個細胞壞死、近端小管和髓袢細段連接處出現顆粒管型等病理改變［3］。人類很少或不存在這種蛋白。若能確定尿蛋白陽性和組織病理學的玻璃樣小滴、透明管型是由α2u球蛋白引起的，則可認為該藥物在臨床使用不會引起類似腎毒性［4］。但是，非臨床安全性評價是一個客觀、嚴謹的分析與評價過程，不能僅根據單個組織病理學觀察結果疑似種屬特異性病變，就得出與人不相關的結論。該案例的數據鏈缺少玻璃樣小滴是α2u球蛋白所致的直接證據，尚不能推斷尿蛋白陽性及玻璃樣小滴變性因α2u球蛋白引起。為此，研究者進一步使用α2u球蛋白抗體進行免疫組化實驗，結果未見抗原抗體結合的陽性染色，直接排除了玻璃樣小滴為α2u球蛋白的可能性。同時，對各個實驗組的腎組織病理學切片進行復閱，發現除近曲小管的玻璃樣小滴外，尚可見腎小管嗜堿性病變、上皮細胞變性、胞漿嗜堿性和透明管型等嚴重程度呈劑量相關性。上述變化與慢性進行性腎病（chronic progressive nephropathy，CPN）的早期組織病理學變化基本一致［5］。CPN是實驗大鼠高發的自發性腎病，發病率和嚴重程度受到蛋白質或熱量攝入、雄性激素、腎蛋白處理能力等多種因素的影響，最早在大鼠2～3月齡時即可出現［6-7］。但是，案例中腎小管嗜堿性病變和部分上皮細胞變性等病變的嚴重程度與藥物劑量相關，無法排除上述病變與給藥的相關性。但根據組織病理學檢查結果中多個特征性改變，本案例認可近曲小管的玻璃樣小滴為大鼠自發性病變CPN的表現，但藥物促進了自發性腎病的發生與發展。至此，研究者應根據藥物相關不良反應的嚴重程度、可逆性等進行利弊權衡，判斷是否在非臨床研究階段中止研究，還是在后續臨床試驗中將腎毒性作為風險點進行嚴格控制。

完整的數據鏈是預測臨床腎毒性的必要條件。非臨床安全性評價時，應對異常病理指標進行充分分析和解讀，根據相互印證的數據判斷病變出現的類型、嚴重程度、進展情況與藥物理化性質、給藥劑量、動物性別等的相關性，分析病變出現的原因以及藥物導致腎損傷的可能機制，提示臨床使用的風險點。同時，充分考慮種屬特異性病變或動物自發性病變的特殊表現，與實驗動物的不良反應進行對比，有針對地進行確證后，方可排除與藥物的相關性。

2 非臨床腎毒性指標的進一步探索

在新藥開發過程中，考察指標的局限性可能將影響毒性評價的準確性。組織病理學檢查受到取樣和工作量的限制，而臨床病理學的常規指標中，尿蛋白、血清Cr和BUN等的變化對于提示腎早期病變相對滯后，血清鈣磷代謝的異常等主要反映晚期慢性腎功能障礙，同時也缺乏特異性。探索早期、敏感的檢查指標是改善非臨床腎毒性低估的重要途徑之一。作為反映腎損傷的生物標志物，應滿足下列條件：①樣本獲取簡易，室溫下穩定；②正常情況下，在腎中表達水平較低或不表達，損傷后表達明顯增加；③腎功能恢復前穩定表達；④表達水平達到臨床病理學分析的檢測限。目前，人用藥物技術要求國際協調委員會（International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）認可7種早期腎損傷的尿生物標志物，分別為白蛋白、β-微球蛋白、血清胱抑素C（cystatin C）、腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，Kim-1）、三葉肽因子 3（trefoil factor 3，Tff3）、叢生蛋白（clusterin）和腎乳頭抗原1（renal papillary antigen-1，RPA-1）［2］，作為常規指標尿蛋白、血清Cr和BUN的補充，可用于非臨床腎毒性的評價。白蛋白因同性電荷相斥作用而無法通過腎小球濾過膜，可用于判定腎小球濾過膜功能變化。β-微球蛋白和血清胱抑素C的相對分子質量較小，且不與其他蛋白結合形成復合物，可自由地經腎小球過濾到原尿中，在近曲小管重吸收并代謝分解，可反映腎小球濾過功能和近端腎小管重吸收功能。Kim-1是近曲小管上皮細胞的一種跨膜糖蛋白，在受損后再生的細胞中高表達，可較早地反映近曲小管的損傷程度。Tff3是一種小分子肽類激素，主要由上皮細胞分泌。叢生蛋白是一種細胞外糖蛋白，腎急性缺血時表達增加。RPA-1是一種特異性分布在腎集合管的膜結合糖蛋白，與腎乳頭損傷程度有較好的相關性。在安全性評價中，敏感的檢查指標可及時、快速地反映腎毒性，甚至在更早期的候選化合物發現階段，通過體外篩選實驗等即可提示化合物的腎毒性。

腎組織病理學改變仍然是非臨床腎毒性評價的金指標［2］。常規組織病理學檢測如不能滿足對病變部位和性質的鑒別，則需要進行特殊染色處理，如過碘酸六胺銀染色（periodic acid-silver methera?mine，PASM）、過碘酸-希夫染色（periodic acid-Schiff stain，PAS）染色和Masson染色等；同時，可通過特殊生物標志物檢測和電鏡觀察等進一步明確病變特征，分析病理機制。組織病理學檢測對病理診斷人員要求較高，不同診斷人員常得出不同的病理檢查結果。因此，應統一病理診斷術語，并開展病理學家的資質認證，提高病理診斷質量。組織病理學診斷術語和診斷標準的國際規范即大小鼠損傷命名和診斷標準國際協調規范（International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria for Lesion in Rats and Mice）對大小鼠的增生與非增生性病變術語與診斷標準已做了統一規定，對規范病理診斷、促進國際間或不同機構間病理學家以及藥物監管部門之間交流起到了積極的推動作用，受到廣泛認可。國內毒性病理學專業人員及藥物監管機構應盡快熟悉或了解。在日常藥物非臨床研究的病理檢測中，應根據實際需要開展必要的內部或外部組織病理學檢查同行評議，確保病理學檢查結論準確可信。

3 結語

新藥研發是一個依據數據不斷向前推進的風險控制過程。非臨床安全性研究是其中不可或缺的重要環節，可為臨床試驗提示需關注的用藥風險點，并為藥物上市后安全、合理用藥提供數據支撐。在某些方面，還可預測臨床研究中監測指標不能反映出來的潛在毒性。在對新藥腎毒性風險進行評估時，應結合完整的非臨床安全性研究數據鏈，總結病變的發生率、嚴重程度和可逆性，分析與藥物劑量的相關性；同時綜合藥物作用機制、動物種屬特點及自發性病變研究等進行分析，評價與人的相關性，以降低臨床用藥風險。