Rab27a基因與外泌體的研究進展①

王小霞，陳煜森，馬曉瑭，潘群文，黃子慧

1.廣東醫科大學附屬醫院神經內科，廣東湛江市524002；2.廣東醫科大學附屬醫院神經病學研究所，廣東湛江市524000

Rab27a基因位于15號染色體的反義鏈上(15q21)，所編碼的蛋白是參與真核細胞中各種囊泡對接、分泌、運輸和融合的鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)酶蛋白家族的重要成員[1]。

1 Rab27a基因概述

1.1 克隆、表達及效應蛋白

Rab蛋白家族的成員是Ras超家族的非轉化單體GTP結合蛋白，其含有涉及GTP結合和水解的4個高度保守區域。Rabs是膜結合蛋白參與囊泡融合和運輸的重要參與者。與其他Rab蛋白相似，Rab27a在GTP結合的活性狀態和鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate,GDP)結合的非活性狀態之間循環。Rab27a在其C端的兩個保守半胱氨酸殘基處發生異戊二烯化，這種修飾在囊泡運輸過程中可將Rab27a錨定到膜上。這是Rab27a參與真核細胞中囊泡和細胞器的靶向對接融合的基礎[1]。研究表明，通過保守Rab蛋白GTP結合結構域的2個序列的簡并寡核苷酸引物對人黑色素瘤細胞cDNA進行PCR，能夠分離編碼Rab27a和Rab27b的cDNA[2]。序列比較顯示，Rab27b是與Rab27a在氨基酸水平上具有71%同一性的同系物[3]。

Rab27a作為Rab家族中的一類Ras小GTP酶，廣泛參與調控真核生物的細胞內膜運輸，其功能的發揮往往都需要Rab27a效應蛋白的參與。到目前為止，已經在人類和小鼠中鑒定了11種與Rab27的GTP結合形式特異性作用的不同Rab27效應物，主要包括以下三組。第一組包含突觸結合蛋白樣蛋白(Slps)和rabphilin(Rab結合蛋白)，其特征在于N-末端Rab27-結合Slp同源結構域(SHD)和C末端串聯C2結構域。第二組含有Slac2(缺少C2結構域的Slp同源物)和Noc2(Rab結合蛋白)。兩者都含有N-末端SHD但缺少C2結構域。第三組僅包含Munc13-4(Rab結合蛋白)，含有兩個獨立的C2結構域和不同于SHD的Rab27結合位點[4]。

1.2 Rab27a基因功能

脈絡膜缺失癥(choroideremia,CHM)是一種X連鎖的視網膜退行性疾病，由Rab Escort蛋白1(Rab Escort protein 1,REP1)突變引起。REP1在Rab GTP酶的異戊烯化中起作用，Rab GTP酶是細胞內蛋白質傳遞的調節劑。Rab27a在Rabs中是獨特的，因為它在CHM細胞中會被選擇性地非甲基化，這表明CHM中的退化過程可能是由于Rab27a的非甲基化和隨后的功能喪失所致[5]。在Rab27a敲除小鼠的視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium,RPE)中，黑素體不能移出黏附連接軸并且不能進入RPE光感受器頂端，這表明Rab27a調節RPE中的黑素體分布[6]。使用小鼠RPE原代培養的活細胞成像來研究黑素體動態，結果表明與皮膚黑素細胞不同，Rab27a的作用是通過Rab27a-Myrip-MyoVIIa復合物(MYRIP、Rab27a效應蛋白、MyoVIIa，肌球蛋白)調節黑素小體束縛到肌動蛋白絲上，該過程確保黑素體向細胞周邊移動[7]。

在皮膚黑素細胞中，Slac2-a/黑素蛋白在成熟黑素體上和基于肌動蛋白的運動肌球蛋白Va之間形成橋接，并且所得到的三聯蛋白復合物促進黑素體從微管轉移至肌動蛋白絲，參與黑素體運輸[8]。Melanophilin(Mlph)是一種與Rab27a-和肌球蛋白Va(MyoVa)結合的蛋白，也可調節黑色素細胞中黑素體轉運這一過程。通過干預Mlph與Rab27a和MyoVa相互作用，可挽救黑素體運輸缺陷[9]。

此外，Rab27a還可以調節溶酶體相關細胞器(lysosome-related organelle,LRO)的轉運和分泌顆粒在各種類型的細胞中的釋放。LRO包括黑素細胞中的黑素體、淋巴細胞中的溶解顆粒、血小板中的δ顆粒和破骨細胞中的“分泌”溶酶體("secretory"lysosomes in osteoclasts,OCL)。Rab27a 基 因 敲 除 灰 鼠(Ashen鼠)OCL顯示，骨吸收活性異常和溶酶體定位明顯減少，表明Rab27a缺陷導致OCL中LRO的異常轉運[10]。有研究表明，Rab27a可促進自然殺傷細胞(natural killer cell)早期脫顆粒，并且不同的NK細胞活化受體優先將Rab27a或Munc13-4募集到含有穿孔素的顆粒中以獲得細胞毒性，突出了Munc13-4和Rab27a之間的脫顆粒相互作用[11]。在細胞溶膠和未受刺激的NK細胞的質膜中，大部分裂解顆粒(lytic granule,LG)是可移動的。研究表明，細胞溶膠中的LG運動需要微管而不是肌動蛋白，而在質膜上的運動則需要微管和肌動蛋白。在質膜上，Rab27a缺陷會使可移動LG比例減少，而在細胞溶膠中，Rab27a缺陷卻可以增加可移動LG比例，增加它們的運動程度[12]。

研究表明，趨化因子CCL5是第一個涉及調節抗腫瘤免疫反應的趨化因子之一。Rab27a或hMunc13-4的缺陷可消除T淋巴細胞分泌顆粒(cytotoxic T lymphocyte cytotoxic granules,CG)胞吐作用和CCL5的突觸分泌。細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)是通過將CCL5儲存在不同于CG的T細胞質囊泡(CTL store CCL5 in cytoplasmic vesicles,CCL5V)中，并且與靶細胞，如肺腫瘤細胞，在免疫突觸(immunological synapse,IS)的Rab27a-hMunc13-4隔室合并，同時觸發CG胞吐以及CCL5突觸分泌的[13]。而CTL裂解顆粒向免疫突觸的終端轉運則由驅動蛋白-1/Slp3/Rab27a復合物介導[14]。此外，Rab27a介導的CTL中溶解顆粒分泌也是免疫突觸處皮質肌動蛋白功能恢復所需的[15]。

在病毒感染方面，Rab27a能通過促進包膜蛋白的細胞表面轉運促進人類parain流感病毒2型的生長[16]。Rab27a可通過指導磷脂酰肌醇4-激酶2型(PI4KII)陽性內涵體向病毒多蛋白Pr55質膜(PM)轉運從而控制HIV-1的復制[17]。在Rab27a沉默細胞中單純皰疹病毒感染少突膠質細胞數量和病毒產量顯著降低[18]。

1.3 基因結構

Rab27a基因包含5個編碼外顯子和2個非編碼外顯子，其中一個可交替使用，并且跨越約65 kB的DNA。在長3'UTR區域中有3個可選擇的poly-A加成位點，還有6個潛在的單核苷酸多態性。通過熒光原位雜交確定該基因位于染色體15q15-21.1上，并通過輻射雜交作圖定位于標記D15S209和AFM321ZD5之間[5]。

1.4 遺傳學特征

Griscelli綜合征2型(Griscelli syndrome 2,GS2)是由Rab27a基因突變引起的一種常染色體隱性遺傳疾病，其臨床特征為部分白化病和嗜血細胞性淋巴細胞增多癥(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)，免疫異常則表現在以細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞裂解活性受損為主。造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是GS2的唯一治愈性治療[19]。

1.5 動物模型

與GS2型患者相對應的小鼠模型Ashen鼠存在Rab27a基因突變，灰色表型也是由于黑色素在黑素細胞的核周區域中積聚，損害了這些顆粒向角質形成細胞轉移，因此導致色素沉著不足，毛發灰色，免疫學特征包括對重復感染的易感性和T細胞細胞毒性活性的缺乏[20]。

研究表明，Ashen鼠存在血小板缺陷，可導致出血時間增加和血小板致密顆粒數量分泌減少或基本正常，但顆粒內部是異常的。膠原介導的Ashen鼠血小板的聚集能力明顯抑制。其他2種主要血小板顆粒，溶酶體和α顆粒，其濃度或分泌率無明顯異常[21-22]。

Rab27a在胰島中高度特異性地表達，在胰腺β細胞中，高葡萄糖刺激下，Rab27a介導胰島素顆粒與質膜的緊密對接。Ashen小鼠顯示葡萄糖不耐受，外周組織沒有胰島素抵抗的跡象或胰腺中的胰島素缺乏。在Ashen小鼠胰島中，胰島素顆粒在質膜上的對接和在葡萄糖刺激期間對接顆粒的補充顯著減少[23]。

還有研究表明，Ashen鼠表現出低繁殖力，Rab27a不參與卵母細胞成熟，但在調控皮質顆粒(cortical granule,CG)胞吐方面發揮重要作用，在小鼠卵母細胞的孤雌激活劑氯化鍶(strontium chloride,SrCl2)孤雌激活后，Rab27a RNAi或抗體注射卵母細胞則不能進行CG胞吐作用[24]。

2 Rab27a基因與多種疾病的關聯性

Rab27a基因位于染色體15q15-21.1上，研究表明，Rab27a蛋白在造血譜系、脾臟、肺、眼睛、胰腺和胃腸道中廣泛表達。其他組織如肝臟、心臟、肌肉、睪丸和腦組織在正確組織灌注時則Rab27a的表達比較少[25]。大量證據顯示，Rab27a基因廣泛參與癌癥、炎癥、血栓形成等疾病的發生發展。

2.1 Rab27a與癌癥及血管形成

研究表明，Rab27a表達水平降低會削弱血管內皮生長因子受體-1(vascular endothelial growth factor,VEGFR1)的棕櫚酰化，降低其穩定性，使血管萌芽和體內血管生成增加[26]。Rab27a基因還能對多種腫瘤的遷移和侵襲等特性產生重要影響，在結腸癌組織和細胞系中，Rab27a過表達時miRNA-582-5P表達下調，而過表達miR-582-5P能夠通過靶向抑制Rab27a從而抑制結腸癌細胞的侵襲能力[27]。在腦膠質瘤中，Rab27a在膠質瘤中的表達高于正常腦組織，且其表達隨著膠質瘤級別進展而增加[28]，Rab27a可以促進膠質瘤細胞的增殖和侵襲，抑制細胞凋亡[29]。在胰腺癌中，Rab27a下調能增強對順鉑的敏感性并誘導人轉移胰腺腺癌細胞(ASPC-1)的凋亡，降低ASPC-1細胞的侵襲和增殖能力[30]。研究表明，在非小細胞肺癌細胞中干擾Rab27a的表達水平能顯著降低腫瘤的增殖和侵襲，促進細胞凋亡，并增加對NSCLC化療藥物的敏感性[31]。很多研究顯示，Rab27a在腫瘤中很可能發揮癌基因的作用，抑制Rab27a的表達能夠抑制腫瘤的生長。因此Rab27a很可能是治療腫瘤的有效靶分子。到目前為止，Rab27a在人類癌癥中的作用還存在一些矛盾的地方，如與正常組織相比，miR-182-5p在胃癌(gastric cancer,GC)組織中以較高水平表達，而Rab27a在癌組織中以較低水平表達。miR-182-5p的下調和Rab27a的上調可顯著降低HGC-27細胞的活力、遷移、侵襲和有絲分裂[32]。這些矛盾的發現表明，Rab27a在特定情況下可能在不同的人類癌癥中具有不同的分子機制，這還有待以后進一步探究。

2.2 Rab27a與炎癥

中性粒細胞響應各種炎癥刺激，可形成嗜中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)，在宿主防御中起著至關重要的作用，而活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生是NETs形成的關鍵。研究表明，Rab27a敲除抑制了ROS陽性吞噬體的形成，也抑制血清處理的白色念珠菌以ROS依賴性方式觸發的NET形成[33]。一方面，Munc13-4可限制表達Rab27a的囊泡運動性以促進脂多糖誘導的嗜中性粒細胞胞吐作用[34]。另一方面，在脂多糖誘導的系統性炎癥模型中，Ashen小鼠對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的死亡具有拮抗性，Ashen小鼠顯示LPS施用后顯著降低的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)的血漿水平和肝臟中嗜中性粒細胞的浸潤，突出了Rab27a在LPS介導的全身性炎癥中以前未被認識到的作用[35]。Ashen小鼠的嗜中性粒細胞在體外和體內表現出遷移缺陷[36]。另外，Rab27a敲除也損害了髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)向血漿中的分泌，干擾JFC1/Slp1-Rab27a分泌機制能夠減弱透化的嗜中性粒細胞中MPO的分泌[37]。有研究表明，Ashen小鼠在內毒素攻擊時顯示極低的嗜中性粒細胞分泌蛋白的血漿水平，說明過表達Rab27a可能有利于阻斷膿毒癥的進展，突出顯示Rab27a作為治療系統性炎癥的新型治療靶標[38]。

2.3 Rab27a與止血和血栓形成

血管內皮細胞含的棒狀分泌細胞器，稱為Weibel Palade體(Weibel Palade body,WPB)，其含有止血蛋白(VWF)、P-選擇素(P-selectin)和炎癥介質等混合物[39]。文獻表明，Rab27a通過其募集多種效應物的能力，在調節WPB胞吐方面起著特別重要的作用，已經證明Rab27a/MyRIP復合體是外周錨定WPB所必需的。這種錨定提供了對胞吐作用的制動，并且可以防止不成熟/較少的多聚VWF的釋放[40]。研究表明，Slp4-a在促進激素激活的WPB胞吐中起關鍵作用，WPB上的Rab27a-Slp4-a復合物通過與突觸融合蛋白結合蛋白1(syntaxin-binding protein 1,SPXBP1)相互作用促進胞吐，從而控制脈管系統中血管活性物質的釋放[41]。雖然血小板還含有Rab27b，可以補償灰鼠中血小板Rab27a缺陷的功能[3]。但是，最近的研究顯示，Ashen小鼠出現血小板聚集功能降低，出血時間延長和血小板致密顆粒分泌數量減少[21]，而Rab27a調節血小板中致密顆粒的分泌機制是通過其效應蛋白Munc13-4實現的[42]。雖然目前還沒有文獻顯示Rab27a與止血和血栓形成直接相關，鑒于Rab27a基因與血小板致密顆粒分泌過程以及血管內皮細胞關系密切，推測Rab27a調節血小板致密顆粒的分泌異常極有可能是通過調節血小板功能或其活化后產生的微囊泡等的釋放作用，從而影響血管內皮細胞的功能以及調節止血和血栓形成等過程。

3 Rab27a基因與外泌體

3.1 Rab27a基因調節外泌體的分泌

外泌體是細胞內在內吞多泡室中形成的小囊泡(直徑50～100 nm)，由大多數細胞類型分泌，包括腫瘤和免疫細胞等。外泌體攜帶了許多生物活性蛋白和核酸，可通過多膜晚期內涵體(multivesicular late endosomes,MVEs)與質膜融合而分泌，參與細胞間通訊、傳染病和退行性疾病等的發病機制。肌動蛋白細胞骨架調節蛋白(an actin-binding protein,coronin)控制質膜(plasma membrane,PM)的MVE停靠位點的數量。Cortactin、coronin1b和Rab27a協調控制MVE對接位點和外泌體分泌的肌動蛋白穩定性[43]。有研究指出，HeLa細胞中有5種促進外泌體分泌的Rab GTP酶。其中，Rab27a或Rab27b敲低減少了MVE與質膜的對接。電子顯微鏡分析顯示，來自Rab27a敲低細胞的MVEs顯著大于來自對照細胞，而在Rab27b敲低細胞中MVEs則較小。另外，沉默兩種已知的Rab27效應物，Slp4和Slac2b分別抑制外泌體分泌和表型沉默Rab27a和Rab27b，電子顯微鏡顯示由Rab27a和Rab27b敲低細胞分泌的外泌體在大小和形態上與對照細胞產生的外泌體相同。表明沉默Rab27a或Rab27b主要是減少細胞培養上清液中釋放的外泌體的量，但不修飾外泌體蛋白質含量或形態學。在Rab27a敲低細胞中Slp4蛋白水平降低，結果顯示Rab27a和Slp4在HeLa細胞的MVE和外泌體分泌途徑中共同起作用。相反，盡管Slac2b的沉默誘導了Rab27b敲低細胞的表型，但還沒有研究證明這兩種蛋白之間的功能相互作用[44]。

Rab27a與外泌體的形成和分泌密切相關，目前Rab27a在外泌體方面的研究主要是通過修飾Rab27a基因來調節外泌體分泌和作用效能，進而干擾疾病的發生發展。

3.2 Rab27a基因與腫瘤來源的外泌體

Rab27a特異性shRNA減少Rab27a表達水平，可以顯著降低非小細胞肺癌細胞系(A549細胞)分泌外泌體[45]，乳腺癌細胞中的Rab27a阻斷也減少了以內吞標記物為特征的外泌體的分泌。阻斷Rab27a可導致原發性腫瘤生長減少和肺轉移性癌(4T1)的播散，但不是非轉移癌(TS/A)[46]。直腸癌(colorectal cancer,CRC)細胞中通過敲低Rab27a可抑制外泌體分泌從而抑制外泌體誘導的內皮細胞增殖和遷移[47]。通過敲除外泌體分泌調節劑Rab27a減少纖維肉瘤細胞向外泌體缺乏的血清的梯度遷移[48]。在B16F10黑色素瘤細胞系中，Rab27a shRNA也可以減少外泌體及一些血管生成生長因子(血小板衍生生長因子，胎盤生長因子)的分泌[46]。將Rab27a過表達載體轉染到人A549細胞中，體外免疫來源于Rab27a過表達細胞的外泌體在小鼠模型中抑制腫瘤生長[49]。這證明了來自Rab27a過表達癌細胞的外泌體可引起更有效的抗腫瘤免疫效應，可為有效的基于外泌體的癌癥疫苗的開發提供新的見解。外泌體向來被認為是腫瘤抗原的理想來源，并且在腫瘤免疫治療中具有潛在的治療作用。總的來說，體內腫瘤局部分泌外泌體可以促進腫瘤進展，而Rab27a又可以調節外泌體的分泌，因此，通過干預Rab27a從而干擾腫瘤的進展，具有臨床意義。

3.3 Rab27a基因與其他來源的外泌體

研究表明，Rab27依賴產生的外泌體能抑制慢性炎癥，并對炎性刺激產生急性應答。實驗證明缺乏外泌體分泌的Ashen小鼠具有以升高的炎性細胞因子和骨髓增生為特征的慢性，低度炎癥表型[50]。在帕金森病MN9D多巴胺能細胞模型的研究中發現，α-突觸核蛋白(alpha-synuclein,αSyn)表達細胞經Mn處理后，Rab27a蛋白增加，其調節外泌體從細胞中的釋放。新一代測序顯示，與對照組外泌體相比，從暴露于Mn的細胞分離的外泌體中存在更多的miRNA。這表明Mn可能通過增加Rab27a蛋白調節外泌體miRNA表達水平，從而導致進行性神經變性[51]。急性骨髓性白血病則通過外泌體分泌將骨髓龕轉化為白血病允許性微環境，通過靶向參與外泌體釋放的重要調節劑Rab27a破壞急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)細胞中的外泌體分泌，可顯著延遲白血病的發展[52]。外泌體還可以將miR-214轉移到成骨細胞中以抑制其功能，Rab27a小干擾RNA抑制外泌體分泌阻止體內卵巢切除誘導的成骨細胞功能障礙[53]。在Ashen小鼠中，移植的骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)在梗死心臟中的存活增加，這表明，受損的心肌細胞衍生的外泌體加速了梗死心臟中移植的BMSC損傷，從而突出了心肌梗死后移植細胞損傷的新機制[54]。

4 總結

Rab27a是Rab家族的一類Ras小GTP酶，參與調控真核細胞內膜運輸。一方面，Rab27a參與黑素體運輸、調節NK細胞及T淋巴細胞等細胞中溶酶體相關細胞器(lysosome-related organelle,LRO)的轉運和分泌顆粒的釋放，其缺失引起GS2和CHM等疾病。另一方面，Rab27a對血管形成及多種腫瘤的遷移和侵襲等能力具有多樣化調控作用，參與腫瘤的發生發展。其缺失通過抑制ROS形成及嗜中性粒細胞的浸潤和功能等方面調節炎癥反應，參與膿毒癥等相關疾病發病。Rab27a缺失還能導致血小板聚集功能降低，血小板致密顆粒分泌數量減少，調控血栓形成等病理過程。此外，外泌體攜帶了許多蛋白質、脂質、mRNA和微小RNA，可參與細胞間通訊，是目前基因和藥物傳遞的新型載體。Rab27a參與調控外泌體的釋放，抑制Rab27a表達水平，不影響外泌體蛋白質含量或形態學，卻能減少外泌體分泌水平。在非小細胞肺癌、乳腺癌、直腸癌等癌癥中，Rab27a敲除能降低癌癥細胞外泌體分泌，抑制其對周圍受體細胞功能的影響，并且Rab27a過表達細胞產生的外泌體可抑制腫瘤生長，提示通過干預Rab27a治療腫瘤的巨大潛力。除腫瘤細胞外，Rab27a還能調控多種細胞外泌體分泌參與疾病發病或發揮治療作用，如神經變形疾病、白血病和心肌梗死等。眾所周知，血小板活化可釋放外泌體和微粒，而且血小板中高濃度表達Rab27a，Ashen小鼠可出現血小板聚集功能降低、出血時間延長和血小板致密顆粒分泌減少等情況。我們的初步研究表明，與C57小鼠相比，Ashen小鼠的血小板微粒在功能上有一定程度的缺失。鑒于血小板來源的微粒及外泌體在血栓形成機制上密切相關，推測Rab27a也可能通過調節血小板外泌體參與血栓形成的發生發展，當然，這還有待進一步探究。