Pig-a基因突變試驗研究進展

鄭丹丹，秦美蓉，王曉煒，王 平

(深圳市藥品檢驗研究院，深圳市藥品質量標準研究重點實驗室，深圳 518057)

致突變物對人類健康影響重大，其與腫瘤、動脈粥樣硬化和糖尿病等基因相關疾病及遺傳疾病的發生密切相關。在藥物開發的早期階段，充分調查化學物質的致突變性，準確對其危害及風險進行識別和評估至關重要。遺傳毒性試驗的目的即是檢測化學物質致突變性，對新型藥物、農藥、香精及香料等的開發過程中化學物質的危害識別和風險評估起重要作用。因此建立靈敏可靠的遺傳毒性試驗方法是全面充分評價人用化學物質致突變性的必要保障。國際人用藥物注冊技術協調會議(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)和經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)關于遺傳毒性試驗的指導原則有明確的闡述，盡量按照包括多個遺傳終點、原核生物、真核生物、體內試驗、體外試驗、體細胞、生殖細胞等幾個原則設置試驗組合，盡可能全面地預測受試物的致突變性，ICH于2011年11月批準了遺傳毒性研究指導原則的修訂案S2(R1)，修訂了遺傳毒性試驗標準組合，更強調體內試驗在遺傳毒性檢測中的重要性[1]。

近年來，一種基于Pig-a基因的基因突變試驗成為研究熱點，該方法基本原理是嚙齒動物暴露于受試物后，Pig-a基因突變導致細胞表面膜蛋白缺失，通過檢測膜蛋白缺失的細胞頻率，對化學物質致突變性進行定量分析。Pig-a基因突變試驗消耗血量少，與其他遺傳毒理學試驗整合的潛力高，且能在普通的動物品系中進行，相對于使用轉基因動物的檢測方法更節省時間、成本，同時能減少動物使用，符合動物福利及3R原則，是未來評價人用化學物質致突變性的重要方法。2014年ICH M7指南已將該測定法描述為用于體外突變陽性結果后續試驗的合適系統[2]。2015年5月該方法被OECD批準納入OECD指導原則并開始起草工作，預計2020年正式生效[3]。本文就Pig-a基因突變試驗的原理、方法、應用及展望等方面進行綜述。

1 試驗原理

1.1 Pig-a基因

磷脂酰肌醇聚糖A類(Pig-a)基因(人類和其他靈長類動物為PIG-A；大小鼠為Pig-a)位于染色體Xp22.1上，全長約17 kb，共有6個外顯子[4]。對Pig-a基因的研究源于陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)。PNH是一種獲得性造血干細胞缺陷性疾病，其特征在于溶血性貧血[5]。研究發現，在造血干細胞中，糖基磷脂酰肌醇(GPI)獲得性缺陷會導致PNH[6]。GPI用于錨定各類真核蛋白質至細胞膜上，對膜表面蛋白的表達至關重要[7]。Nishimura等[8]分析了146例PNH患者，發現導致GPI缺陷的基因突變類型均在Pig-a基因座內。Rosse等[9]研究表明，在已檢測的PNH患者血細胞中，發現都有Pig-a基因突變導致GPI錨定蛋白(GPI-APs)部分或全部缺失的現象。這表明，Pig-a基因突變可能會導致GPI缺陷從而導致GPI-APs表達障礙，最終出現PNH癥狀。后證實，Pig-a基因參與GPI生物合成的第一步。GPI在內質網中合成，第一步合成是在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)轉移酶的催化下，將GlcNAc從UDP-GlcNAc轉移到磷脂酰肌醇(PI)中，生成GlcNAc-PI[10]。GPI生物合成中的第一步需要Pig-a基因編碼GlcNAc轉移酶的催化亞基，同時還需要基因Pig-h和Pig-c的參與，上述任意一個基因的突變都能導致該反應的完全缺陷[11]。

GPI整個合成過程中約有二十幾個基因參與，參與第一步合成的基因還有Pig-c、Pig-h等。理論上涉及GPI合成的任何一個基因突變都可能導致GPI缺陷，然而，所有其他基因都位于常染色體上，必須發生兩個等位基因的突變才能導致GPI缺陷，而這是非常罕見的。由于人類在胚胎發育中，兩條X染色體的一條發生了隨機滅活，因此X連鎖的Pig-a基因只需單一突變足以誘導GPI缺陷[12]。所以，GPI缺陷表型通常歸因于Pig-a基因突變。Miura等[13]對GPI缺陷型大鼠淋巴細胞中的Pig-a基因進行了測序，并證明在這種情況下，GPI缺陷表型實際上等同于突變體基因型。此外Kawagoe等[14]還證實X染色體上基因的結構、功能和位置存在高度的種間保守性。這意味著采用 Pig-a 基因突變試驗進行化學物遺傳毒性評價，有利于將動物試驗結果外推于人。

1.2 Pig-a基因突變試驗

1999年，Araten等[15]首次提出了Pig-a基因可作為體內基因突變試驗的報告基因。2008年Bryce和Miura等[16-17]使用Pig-a作為突變報告基因成功建立嚙齒動物Pig-a基因突變試驗方法，并證明在陽性劑處理的嚙齒動物中Pig-a基因突變表型的紅細胞增加。后在美國國立衛生研究院及美國環境健康科學院(NIH-NIEHS)的資金支持下，日本環境誘變劑學會(J-EMS)，美國食品藥品監督管理局(FDA)和國際生命科學研究院健康與環境科學研究所(ILSI-HESI)等組織對方法進行優化，得到能分析更多總紅細胞(RBC)和網織紅細胞(RET)的先進方法，增強了方法的靈敏度[18]。

遺傳毒性測試國際工作組(IWGT)Pig-a工作小組在2013年報告中提出體內大鼠Pig-a測定法可在監管毒理學中發揮重要作用，但也指出一些數據缺口。后各實驗室進行多次Pig-a試驗，填補了IWGT提出的數據缺口。Kenyon等[19]測試了可能通過干擾紅細胞生成而出現陽性反應的化學物質，結果表明再生造血不會干擾Pig-a基因突變的測定結果。Stankowski等[20]將Pig-a基因突變試驗、微核試驗、染色體畸變試驗以及彗星試驗整合到28 d大鼠毒性試驗。Bemis等[21]通過區分遺傳毒性致癌物氨基甲酸乙酯和結構相似的非遺傳毒性化學物氨基甲酸甲酯來評估大鼠Pig-a檢測法的特異性，結果表明Pig-a檢測法具有區分遺傳毒性和非遺傳毒性的價值。Labash等[22]通過對比雄性和雌性大鼠的自發突變頻率，以及比較使用N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)誘導后兩種性別大鼠的反應，證明雄性和雌性大鼠同樣適用于Pig-a檢測。Godin-Ethier等[23]對方法在實驗室內的重現性、變異性和血液儲存穩定性進行評估，結論是大鼠Pig-a測定法是可靠的。Roberts等[24]采用一次性給藥以及相同累積劑量重復給藥兩種方案評估了4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)誘導Pig-a突變型的結果表明，重復給藥方案在Pig-a測定中產生更有效的反應。

通過DNA測序分析驗證突變體是“真的”Pig-a基因突變體，對于突變頻率的確定至關重要。該驗證已在大鼠CD48缺陷的T細胞中，通過流式細胞術分選突變細胞和擴增單細胞的Pig-a基因測序得以進行[25]。Revollo等[26]將隨機DNA標識符(mutation analysis with random DNA identifiers,MARDI)應用于DMBA(dimethylbenz(a)anthracene)處理的大鼠的CD48缺陷型T細胞的異質庫的Pig-a cDNA分析中，結果MARDI檢測到幾乎所有先前通過克隆分析鑒定的Pig-a突變。

2 實驗方法

2.1 流式細胞術法

使用流式細胞術對外周血Pig-a基因突變進行檢測的方法目前主要有兩種，北美和歐洲最常用的方法是使用試劑盒In Vivo MutaFlow?(Litron Labs)，其原理是：首先通過分離液去除白細胞，然后用帶熒光標記且能與GPI-APs結合的抗體(如大鼠為抗CD59抗體)孵育細胞。野生型紅細胞由于細胞膜表面GPI-APs正常表達，因此能夠與抗體結合而帶有熒光標記，突變型細胞因表面缺乏GPI-APs不與抗體結合不帶有熒光標記。使用流式細胞儀進行檢測，即可通過熒光信號的強弱區分識別野生型紅細胞及突變型紅細胞。同時使用帶有熒光的核酸染液進行孵育，即可區分NCE(normochromatic erythrocyte)及RET(reticulocyte)。通過磁性分選來特異性地減少樣品中的野生型細胞，可有效評估更多的RBC(erythrocyte)和RET，減少測量時間，降低測量誤差[27]。另外，日本有實驗室使用熒光抗體HIS49(大鼠)檢測紅細胞；熒光抗CD59抗體(大鼠)檢測GPI錨定標記，同時轉鐵蛋白受體(CD71)作為RET的標記。一項比較兩種方法的研究結果發現產生了類似的Pig-a突變頻率[28]。

流式細胞術法檢測只需要少量血量，對動物只是微創，符合動物福利的要求，且能進行多次采血，可使用同一組動物進行長期研究。由于使用的是普通嚙齒動物，相對于轉基因小鼠基因突變試驗以及Hprt基因突變試驗成本更低，檢測時間短，適用于常規檢測。采用流式細胞術法還可以將Pig-a基因突變試驗整合到28 d大鼠毒性試驗中，節省動物和成本，符合3R原則。與此同時，通過流式細胞術分選突變細胞和Pig-a基因測序能對突變體進行確證，這對于突變頻率的確定至關重要。但流式細胞術法對適用Pig-a檢測的組織有一定的限制。例如，樣品必須制備單細胞懸液，并且細胞不能經過任何可能改變細胞表面膜蛋白的處理(如蛋白水解消化)等。目前，這兩個要求限制了Pig-a測定法只能在造血組織中應用。

2.2 有限稀釋克隆法

氣單胞菌溶素原是由細菌性病原體嗜水氣單胞菌分泌的毒素。氣單胞菌溶素原釋放后通過蛋白水解激活形成氣單胞菌溶素，后者結合敏感細胞后低聚，插入細胞膜并形成破壞滲透性屏障的離散通道從而殺死靶細胞[29]。Diep等[30]證明，對氣單胞菌溶素敏感的細胞共同特征是細胞表面都含有GPI錨。Brodsky等[31]發現PNH血細胞(紅細胞，淋巴細胞和粒細胞)對氣單胞菌溶素的細胞毒性作用具有抗性，且暴露于氣單胞菌溶液的PNH細胞的裂解百分比與通過流式細胞術測定的樣品中CD59+細胞的百分比平行。Abrami等[32]發現氣單胞菌溶素原在細胞表面與GPI結合后被蛋白水解成氣單胞菌溶素，其最終形成跨膜孔并引起細胞死亡。2008年，Miura等[13]基于上述原理建立了通過使用氣單胞菌溶素原及cDNA測序對大鼠脾淋巴T細胞Pig-a基因突變進行檢測的方法，即有限稀釋克隆法。該法原理是：使用氣單胞菌溶素原作為選擇劑，氣單胞菌溶素原能與GPI APs結合水解產生氣單胞菌溶素，后者導致細胞膜破損，細胞死亡。而Pig-a基因突變細胞由于GPI APs表達缺陷，不與氣單胞菌溶素原結合，從而得以存活，在96孔板內長成集落。

有限稀釋克隆法能夠直觀地鑒別突變細胞，獲得的突變細胞集落還可進行更進一步的研究。但該方法需要對細胞進行培養，較流式細胞術法耗時較長，且與其他試驗的整合能力較差。現使用該方法進行Pig-a基因突變檢測的試驗較少。

3 應用進展

2008年，HESI的遺傳毒理學技術工作小組成立了Pig-a工作小組，致力于方法的進一步優化。在NIH-NIEHS的基金支持下，由Litron Labs和ILSI-HESI的科學家聯合制定統一的實驗方案，對Pig-a測定法進行國際聯合驗證。該驗證計劃由美國國家毒理學研究中心、輝瑞、雅培、諾華和拜耳制藥等14個不同機構組織的實驗室參與，統一采用Litron Labs提供的試劑盒(大鼠品系和流式細胞儀由實驗室自行決定)，檢測41個試劑，驗證該方法的靈敏度和重復性。驗證實驗分四個階段[33-38]。第Ⅰ階段為參加方法驗證實驗室的信息收集，第Ⅱ階段為參加驗證的14個實驗室用相同劑量的ENU及試劑盒檢測突變表型RBCCD59-RETCD59-發生率，并與Litron Labs數據進行比對[33]。第Ⅲ階段采用28天重復劑量設計，使用ENU[34], DMBA[35], N-甲基-N-亞硝基脲[36], BaP[37]和4-NQO[38]等試劑進行試驗，每個試劑至少有兩個實驗室參與驗證。第Ⅳ階段主要是對弱致突變劑和非致突變劑進行測試，增加實驗系統對弱致突變劑和非致突變劑的靈敏度以及結果可信度。驗證第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ階段的報告現已發表，初步證明Pig-a基因突變試驗具有良好的靈敏度、可靠性和重現性，還建立了通過免疫磁性分離技術增加樣品可評估細胞量的方法[39]。第Ⅳ階段研究也已獲得進展，現部分工作已被公布[25, 40-41]。國內僅中國醫藥工業研究總院的國家上海新藥安評中心參與該驗證計劃，評價了ENU、三聚氰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)和4NQO四種不同遺傳毒性作用機制化合物在SD大鼠體內微核試驗和Pig-a基因突變試驗中的遺傳毒性，并作為國際聯合驗證結果的一部分總結于IWGT對Pig-a試驗的總結報告中[42]。

目前，Pig-a基因突變試驗還可在以下方面開展工作[43]：①進一步確認Pig-a基因突變型與GPI缺陷表型之間的關系；②分析甲基化/去甲基化對測定性能的影響；③對更多非致突變劑進行測試，尤其是通過不同機制干擾紅細胞生成的試劑；④檢查長時間給藥(如90 d)對測定性能的影響；⑤使用大鼠以外(如人，小鼠，狗，豬等)的實驗動物建立方法；⑥建立使用其他血細胞(如T淋巴細胞和粒細胞)的方法；⑦探索Pig-a測定法在測量固體組織(例如肝臟)細胞突變的實用性；⑧開發體外細胞測定法；⑨探索測定法用于測量生殖細胞中的突變等。

4 展望

迄今為止，大鼠已作為Pig-a法一種關鍵的嚙齒動物模型，用于監管毒理學研究。然而，Pig-a基因突變試驗能否在小鼠模型中成功應用至關重要，因為小鼠在毒理學中也發揮著非常重要的作用。Phonethepswath等[44]將CD-1小鼠暴露于DMBA和ENU，結果顯示RET和RBC中檢測到明顯的Pig-a基因突變，結論是Pig-a檢測可以有效地應用于小鼠。Bhalli等[45]使用不同品系的C57BL/6小鼠暴露于ENU進行Pig-a檢測，結果顯示RET和RBC中檢測到明顯的Pig-a基因突變。后有研究使用小鼠Pig-a法測試了幾種多環芳烴(PAH)，其中DMBA和苯并[a]芘(benzopyrene，BaP)檢測到明顯的Pig-a基因突變。而BaP的誘變效應在幾種品系小鼠不同暴露途徑下是顯著的，包括在MutaTM小鼠模型中灌胃給藥28 d；在Gptδ小鼠中單次灌胃給藥；在C57BL/6野生型和DNA修復缺陷型小鼠中腹腔注射3 d；在CD-1小鼠中灌胃給藥3 d[44,46-50]。這表明，對于典型的致突變劑PAHs DMBA和BaP，小鼠Pig-a基因突變測定能夠揭示其遺傳毒性潛力。目前基于小鼠進行的Pig-a檢測數據相對較少，需要使用更多致突變劑、弱致突變劑及非致突變劑進行試驗來更進一步表征Pig-a檢測法在小鼠中的靈敏度。

Pig-a基因在哺乳動物中具有高度的保守性，也為人群中開展Pig-a基因突變檢查以及轉化毒理學研究提供了可能。Dobrovolsky等[51]研究表明PIG-A測定可用于檢測人體內的體細胞突變。Dertinger等[52]研究表明可使用基于嚙齒動物的標記和分析方案對人類PIG-A突變表型細胞頻率進行有效和可靠的評估。Cao等[53]對人類的自發突變頻率(MF)、男女性MF對比、 MF和年齡之間的相關性、MF在吸煙者和非吸煙者之間的差異以及個體差異等進行了研究，為人類PIG-A測定法的建立提供了基礎數據。

此外，檢測生殖細胞中的突變可能會成為Pig-a測定法重要的應用方向之一。Ji等[54]應用Pig-a測定法對大鼠附睪精子進行生殖細胞誘變性評估，結果和預期頻率之間達到良好的一致性，認為大鼠表皮精子Pig-a檢測是評估生殖細胞致突變性的有希望的方法。

5 小結

GPI生物合成途徑在大多數哺乳動物物種中是保守的，包括小鼠、大鼠、猴以及人類等。在人類和實驗動物中評估Pig-a基因突變的能力，意味著可在動物模型中測試人類對潛在致突變劑的反應。此外，人類PIG-A測定可能在臨床環境中具有價值，在實驗動物中進行的Pig-a測定可為體內內源性突變提供參考。例如，Pig-a和PIG-A測定可用于監測基因毒性化合物的長期毒性[55]，有助于評估繼發性惡性腫瘤發生的可能性。此外，PIG-A測定還可用于流行病學研究，用于監測暴露于潛在不利環境中的人群的健康狀況(突變累積)。

雖然Pig-a測定目前在組織覆蓋方面存在局限性，且直接證明紅細胞反應的突變基礎非常困難。但是，由于Pig-a測定法具有與其他試驗整合潛力高，較高的臨床參考價值，對致突變劑反應敏感，成本相對較低，測定終點為內源性哺乳動物基因表型突變等優點，筆者認為Pig-a測定法未來將成為體內遺傳毒理學檢測的重要方法。