海月水母(Aurelia aurita)精巢發育及精子的超微結構*

陳昭廷 周 洋 顧志峰 劉春勝① 陳四清① 劉長琳

(1. 海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室 海口 570228; 2. 海南大學海洋學院 熱帶生物資源教育部重點實驗室海口 570228; 3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071)

海月水母隸屬刺胞動物門(Cnidarian)缽水母綱(Scyphozoa)旗口水母目(Semaeostomeae)海月水母屬(Aurelia), 是世界廣布性水母物種, 多分布于近岸半封閉海灣地區, 其暴發可堵塞電廠管道、破壞海洋生態系統和漁業資源結構, 從而造成巨大經濟損失(Mills, 2001; Dong et al, 2010; 王建艷等, 2012; 王世偉等, 2012; 孫松, 2012; Liu et al, 2015)。在生物進化過程中, 海月水母所屬的刺胞動物是最為原始的真后生動物, 是其他高等多細胞動物的起點(周春婭等,2013)。它們歷經 6億多年的進化歷史和環境變遷而保持種群能長盛不衰, 與其特殊的繁殖方式密切相關, 因此開展海月水母生活史研究對解析其種群動態變化極為重要(孫松, 2012)。

海月水母的生活史分為兩個階段, 即浮游的水母體階段和底棲的螅狀體階段(Hernroth et al, 1985;Miyake et al, 1997), 其中有性繁殖是海月水母螅狀體種群補充的重要來源之一。目前, 針對該物種生活史研究主要集中在螅狀體階段, 而對于浮游階段, 尤其是有性繁殖過程鮮有報道。我們前期利用顯微觀察方法對海月水母的精巢發育和排精過程進行了初步研究, 然而對其發育過程中的內部組織結構變化及精子超微結構相關工作尚未了解(陳昭廷等, 2015)。

基于此, 本文擬通過石蠟切片和蘇木精-曙紅染色(hematoxylin-eosin straining, HE)技術開展海月水母精巢發育過程研究, 并利用掃描電鏡和透射電鏡對海月水母精子超微結構進行觀察, 其結果對于豐富海月水母繁殖生物學知識具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用海月水母螅狀體由中國科學院海洋研究所提供。螅狀體經暫養后, 放置于(13±1)°C條件下,低溫誘導3周, 使其橫裂產生碟狀體。

選取不同規格的健康活潑的雄性海月水母作為實驗對象, 所選個體的具體體型參數如表1所示。

表1 海月水母形態參數Tab. 1 Medusae of Aurelia aurita used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 海月水母的培育管理 碟狀體至水母體變態前階段: 初生碟狀體養殖于 0.5m×0.5m×0.5m的塑料水槽中, 充氣培養, 每日投喂足量鹵蟲無節幼體 2次(以碟狀體胃中是否充滿鹵蟲無節幼體為標準), 投喂2h后換水50%。

水母體階段: 將變態完全的水母體從塑料水槽轉到圓形亞克力水母缸(其中養殖室直徑 77cm, 厚度30cm, 轉速 2r/min)中進行培養, 每日投喂足量鹵蟲無節幼體2次(以每次水母體四個馬蹄形胃中充滿鹵蟲無節幼體為標準), 投喂 4h后換水 50%。每周清洗水母缸一次。

實驗所用海水為經過二級砂濾的自然海水, 水溫22°C 左右, 鹽度 28—30, pH7.8—8.2, 溶解氧≥6mg/L。1.2.2 海月水母精巢組織學觀察 取表 1所示各發育階段海月水母生殖腺, 切成 0.5cm長的組織片,于Bouin’s液中固定24h; 梯度酒精脫水; 石蠟滲透,包埋; 常規組織切片 5μm; 愛氏蘇木精曙紅(雷根生物技術有限公司, 北京)染色。在 Olympus顯微鏡(Olympus AX, 日本)(目鏡 10×)下觀察每組海月水母的性腺發育狀況。性腺發育過程描述方法參照Drummond等(2006)并加以改進。

1.2.3 海月水母精子的電鏡觀察 參照陳昭廷等(2015)的方法對性腺成熟的海月水母催熟排精, 取精子細絲備用。

掃描電鏡精子樣品制備與觀察: 采集剛排出的精子細絲于 25mL樣品管中, 加入海水進行稀釋, 充分混勻后, 取1mL精子稀釋液于5mL EP管中, 加入2.5%的戊二醛(0.2mol/L PBS配制, pH7.2, 4°C)固定樣品, 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗。酒精梯度脫水后, 進行乙酸異戊脂置換。采用二氧化碳臨界點干燥器(XD-1型, 美國Eiko公司)干燥,用離子鍍金儀(IB-3型, Eiko公司, 美國)噴金鍍膜,用掃描電鏡(JSM-840, JEOL公司, 日本)觀察。

透射電鏡精子樣品制備與觀察: 采集剛排出的精子細絲于5mL樣品管中, 加入海水進行稀釋, 充分混勻后, 2000r/min離心5min, 棄上清液。PBS緩沖液沖洗, 1%鋨酸4°C后固定4h。PBS緩沖液沖洗后, 乙醇系列梯度脫水, Epon812環氧樹脂(中興百瑞, 北京)包埋。Ultracut E超薄切片機(Ultracut EUItramicrotome,Reichert-Jung公司, 德國)半薄切片, 甲苯胺藍染色,半薄定位。醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色。用透射電鏡(JEM-1200EX, JEOL公司, 美國)觀察。

2 結果與分析

2.1 海月水母精巢發育組織學分期

根據濾泡的形態變化及濾泡中生殖細胞的發育階段, 將海月水母的精巢發育分為 4個時期: 增殖期、生長期、成熟期和排放期。

增殖期: 雄性生殖腺內濾泡逐漸出現, 濾泡壁不明顯, 濾泡中逐漸形成精原細胞, 胞徑約為 7.2—10.3μm。此期未見精子細胞及精子出現(圖1a)。

生長期: 濾泡壁逐漸變得清晰, 濾泡中大部分為初級精母細胞, 也存在個別的精原細胞。初級精母細胞排列緊密, 逐漸形成次級精母細胞, 胞徑約為 1.8—3.4μm(圖 1b)。

成熟期: 濾泡與濾泡之間界限明顯, 濾泡中存在次級精母細胞、精子細胞及成熟的精子, 且成熟的精子占有較大比例。精子細胞中細胞核占的比例較大,著色較深, 胞質不明顯。精子頭部著色較深, 體積最小。精小囊界限開始模糊, 成熟精子移動到濾泡中央區(圖 1c, d)。

排放期: 濾泡壁增厚, 成熟精子幾乎占滿整個濾泡(圖1e), 有的濾泡由于成熟精子的排放出現空腔(圖1f)。

同一精巢不同部位的濾泡處于不同發育時期,如圖1a中濾泡處于增殖前期和增殖期, 圖1c中濾泡處于成熟期和排放期。此外, 通過觀察發現, 雄性個體排精周期可達2周以上。

2.2 海月水母精子超微結構

2.2.1 掃描電鏡觀察 海月水母精子呈長尖辣椒狀, 由頭部、中段和尾部組成, 全長約為33.62μm(圖2a)。頭部長度約為 5.84μm, 表面凹凸不平, 具頂體,頂體細長呈錐形, 約為1.75μm(圖2b)。尾部主要為細長的鞭毛, 長度約為27.78μm(圖2a)。

圖1 海月水母精巢各發育階段Fig. 1 The developmental stages of A. aurita testis注: a. 增殖期: 精巢逐漸開始發育, 出現濾泡(F); b. 生長期: 濾泡逐漸增大, 內部出現顆粒狀精母細胞; c. 成熟期(縱切)和d. 成熟期(橫切): 濾泡壁增厚(Fw), 濾泡腔(Fc)中出現大量成熟精子; e. 排放期: 大量成熟精子開始排放; f. 排放后期: 部分濾泡出現空洞, 開始萎縮。Mg. 生殖腺; F. 濾泡; Fc. 濾泡腔; Fw. 濾泡壁; s. 精子。

2.2.2 透射電鏡觀察

(1) 頭部

由頂體和細胞核構成, 質膜與核膜明顯。質膜表面不平整, 與核膜之間有較大空隙, 兩者間具細胞質,電子密度較低。頂體電子密度不均勻, 前端電子密度高, 無亞頂體腔, 頂體后方為細胞核, 兩者之間界限明顯(圖 2c)。細胞核為鈍圓錐形, 稍微彎曲, 長度約為 4.15μm, 前端直徑約為 0.31μm, 后端直徑約為1.54μm(圖2d)。核內染色質致密, 電子密度最高。核后端形成較淺的核后窩, 與近端中心粒相連。

(2) 中段

海月水母精子中段不發達, 由中心粒復合體和線粒體構成, 具袖套結構(圖2e、f)。縱切面上可見1—2個線粒體在細胞核后端與細胞核緊密相連, 基體突出, 與軸絲相連, 形成鞭毛。中心粒復合體主要由近端中心粒和基體組成, 由橫切片可知, 近端中心粒與基體呈“T”型排列, 基體由 9組三聯微管組成, 無中央微管對(圖2g中g′所示)。線粒體為 4—5個, 圓環狀排列, 長徑約為 1.03μm, 線粒體電子密度不均勻, 近心處電子密度高于離心處(圖 2g), 線粒體脊明顯可見。袖套較淺, 位于線粒體下方, 袖套內膜與鞭毛外膜部分融合, 袖套腔很小, 呈卵圓形, 長徑約為267nm, 左右對稱(圖 2e)。

(3) 尾部

尾部為一條細長的鞭毛, 直徑約為443nm, 由內部的軸絲和外部的質膜構成(圖2h)。軸絲由基體向后延伸生成, 具有典型的“9+2”雙聯體微管結構(圖 2i),質膜呈波浪狀, 無側鰭。

3 討論

3.1 海月水母精巢發育分期

海月水母生活史復雜, 包括營附著生活的螅狀體階段和營浮游生活的水母體階段。本研究對海月水母水母體進行室內養殖, 發現其壽命約為5個月, 這與已報道的自然海區的海月水母壽命相似(Miyake et al, 1997; Lucas, 2001)。實驗結果表明, 對海月水母水母體而言, 其生命周期中僅有1次生殖腺發育, 待其排精后, 個體也隨之自溶死亡。通過對各期的組織切片進行觀察分析可知, 同一時期, 不同濾泡發育程度不同, 同一濾泡內不同部位發育程度也略有差異, 但同一精小囊內的生殖細胞發育同步, 由此認為海月水母雄性排精方式為多次連續型。

圖2 海月水母精子超微結構Fig. 2 The ultrastructure of sperm of A. aurita注: a. 精子, 示頭部(H)、鞭毛(F)、尾部末端(EP); b. 精子頭部, 示頂體(A); c. 精子頭部縱切, 示質膜(PM)、核膜(NM)及細胞核(N); d. 精子頭部和中段縱切面, 示線粒體(M); e和f. 精子中段縱切面, 示基體(BB)、袖套(S)、袖套內膜(OM)及袖套內膜(IM); g(g′). 精子中段橫切面, g示線粒體結構, g’示基體與近端中心粒(PC)呈“T”形排列; h.鞭毛縱切面, 示中心微管(CM)及雙聯體微管(DM); i. 鞭毛橫切面, 示中心微管及雙聯體微管的“9+2”結構。

海月水母的精巢發育過程, 與某些貝類相似, 如中國蛤蜊(Mactra chinensis)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)等(Drummond et al, 2006; 楊林等,2010)。貝類在形成期前還有一個休止期, 無性腺, 難以辨別雌雄, 大部分為結締組織。在形成期, 產生濾泡。隨著發育的進行, 濾泡逐漸增大, 濾泡內的生殖細胞也發生相應的變化, 由最初的精原細胞逐漸發育為成熟的精子, 最終排出體外。排放期后, 濾泡萎縮, 進入耗盡期。據陳昭廷等(2015)對海月水母精巢成熟過程的報道, 海月水母的精巢發育起始于生殖上皮, 精小囊不斷增多, 精巢開始發育。由于是形態學的觀察結果, 其認為這種結構與小葉型的魚類精巢發育類似。通過組織切片觀察, 我們認為海月水母的這種精巢發育方式更類似于貝類濾泡的發育過程,但有所差異。海月水母的精巢發育分期并不如貝類明顯, 其發育不同步, 即在生殖腺的不同部位, 有多個發育時期同時存在。這與貝類精巢發育過程顯然不同,更類似于仿刺參(Apostichopus japonicus)和某些硬骨魚類的精巢發育過程(龐震國, 2006; 溫海深等,2007)。海月水母具有四個馬蹄形生殖腺, 每個生殖腺發育程度并不同步, 這種模式更有利于保證排精的持續性, 對于種族的延續具有重要意義。

3.2 海月水母精子超微結構

關于水母類精子超微結構的研究未見報道, 本文首次對海月水母的精子超微結構進行了研究。通過對比部分貝類、甲殼類、棘皮動物及硬骨魚類的精子超微結構(表 2), 分析討論了海月水母精子超微結構與其他物種的異同。

(1) 精子頭部

海月水母精子頭部包括頂體和細胞核兩部分。頂體是精子頭部的重要組成部分, 其結構的復雜程度往往能反應精卵結合的難易。體外受精的大多數雙殼貝類均具有頂體結構, 這是由于雙殼貝類大多為體外受精且卵膜結構復雜, 無受精孔, 精子入卵部位隨機, 要發生復雜的頂體反應才能完成精子入卵(董迎輝等, 2010)。而大多數硬骨魚, 如斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、條斑星鰈(Verasper moseri)、半滑舌鰨( Cynoglossus semilaevis)等, 其精子無頂體,這是由于其卵子具有受精孔結構, 精子入卵無需進行頂體反應(趙會宏等, 2003; 吳瑩瑩等, 2008; 徐永江等, 2010)。海月水母的頂體尖細, 呈錐形, 這與文蛤(Meretrix meretrix)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)的精子頂體相類似。由此可以推測, 海月水母精子入卵過程需要進行復雜的頂體反應(竺俊全等, 2004; 韓厚偉等, 2008;董迎輝等, 2010)。

海月水母精子的細胞核為稍微彎曲的鈍圓錐形,電子密度很高, 無核泡, 形狀類似于文蛤、仿刺參的細胞核形狀(姚紅偉等, 2009; 董迎輝等, 2010), 然而其細胞核無核前窩, 核后窩及植入窩亦不明顯, 顯然與硬骨魚類有較大區別, 如半滑舌鰨(吳瑩瑩等,2008)。由此認為海月水母的細胞核在進化程度上較為原始。

在本研究中還發現, 海月水母的核膜和質膜之間具豐富的細胞質, 其與已報道的貝類、棘皮動物及硬骨魚類顯著不同。從生殖生物學角度, 精子主要為卵子受精提供遺傳物質, 精子頭部的關鍵物質即為染色質, 因此過多的細胞質是一種不完善的進化標志。此外,實驗發現少數海月水母精子存在雙核現象, 該現象或許是精子發育畸形造成, 其機制尚待進一步研究。

(2) 精子中段

海月水母精子中段包括線粒體、中心粒復合體和袖套結構。線粒體為4個, 形狀不規則, 線粒體脊明顯, 其個數與蝦夷扇貝的類似, 而表2所列多數物種的線粒體數以 5個居多, 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)線粒體為2—3個, 仿刺參的線粒體甚至融合為一體。線粒體數目的多少是區別種屬的特征之一, 也是受精方式的適應和生殖進化的象征(葉素蘭等, 2008)。

中心粒復合體由近端中心粒和基體組成, 兩者的排列方式與文蛤、毛蚶、皺紋盤鮑(Hdiscus hannai)等多數物種相似(包振民等, 1998; 竺俊全等, 2004;董迎輝等, 2010), 呈“T”型, 不同于斜帶石斑魚的“＞”型及半滑舌鰨等高等魚類的線性排列方式(趙會宏等,2003; 吳瑩瑩等, 2008)。這種垂直排列的方式被認為是一種原始的排列方式(徐永江等, 2010)。

海月水母具有袖套結構, 這與半滑舌鰨及星突江鰈(Platichthys stellatus)的精子相類似(吳瑩瑩等,2008; 劉長琳等, 2009)。海月水母精子袖套腔封閉,袖套內膜與尾部質膜相互融合, 更類似于星突江鰈的精子(劉長琳等, 2009), 但與后者相比, 前者袖套較為發達, 可將線粒體完全包裹。袖套內除線粒體之外, 還存在一些由高爾基體退化形成的囊泡(管汀鷺,1990)。海月水母袖套相對發達實際上是其進化不完全的特征之一。

(3) 精子尾部

海月水母精子的尾部為鞭毛, 由軸絲和質膜組成, 軸絲為典型的“9+2”結構。這與表 2中的大多數物種精子尾部形似, 而不同于三疣梭子蟹(李太武,1995)。鞭毛的作用主要為游泳, 而三疣梭子蟹是以精莢的形式進行受精的, 故不存在鞭毛結構。本研究中還發現了少數精子中存在2條軸絲共質膜的現象, 這與韓厚偉等(2008)報道的蝦夷扇貝及姚紅偉等(2009)報道的仿刺參的鞭毛中存在 2條軸絲共質膜的現象相類似。韓厚偉等(2008)認為, 這是由于海水污染致畸造成的, 其機理究竟如何還未可知。海月水母的鞭毛無側鰭, 也無囊泡存在, 這與一些硬骨魚類的精子鞭毛有較大差異(吳瑩瑩等, 2008)。

4 結論

海月水母生殖系統較為原始, 其精巢是由兩層外膜包裹的大量長圓形濾泡組成, 發育過程可分增殖期、生長期、成熟期和排放期四個階段。海月水母精子全長約 33.62μm, 其頭部呈長尖辣椒狀, 具頂體,核膜與質膜空隙較大, 充滿細胞質; 中部具有較發達的袖套結構, 袖套內膜與鞭毛質膜相互融合, 線粒體以 4個居多, 呈圓環狀排列; 尾部細長, 由質膜和軸絲組成, 軸絲橫切面為典型的“9+2”結構。綜上所述,海月水母雄性生殖系統和精子結構均較為原始, 但其精子具有分批成熟排放的特性, 從而延長了雄性海月水母的有性生殖周期, 有利于種族的延續。

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