金烏賊(Sepia esculenta)繁殖模式的分子學鑒定*

汪金海 韓 松, 鄭小東①

(1. 中國海洋大學水產學院 青島 266003; 2. 天津耀華中學 天津 300040)

金烏賊(Sepia esculenta), 俗稱烏魚、墨魚, 隸屬于軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、烏賊目(Sepiida), 自日本海到菲律賓群島的 40—100m淺海區域均有分布(Okutani, 2005)。在我國, 金烏賊廣泛分布于黃海、渤海、東海以及南海海域, 在海洋漁業中占有重要地位。目前有關金烏賊的形態學(鄭小東等, 2002; 韓松等, 2010)、胚胎發育(李嘉泳,1965)、人工繁育與營養(鄭小東等, 2003; 趙厚鈞等,2004)、增殖放流(郝振林等, 2008)以及遺傳多樣性(Zheng et al, 2007, 2009)等方面已開展了諸多研究,但是有關繁殖方式、交配模式等繁殖行為學研究鮮有報道。

近年來, 由于近海環境惡化和過度捕撈造成我國沿海金烏賊資源量銳減。有效維持甚至提高人工繁育群體的遺傳多樣性水平, 避免后代因奠基者效應引發自交衰退, 是水產工作者亟需解決的課題。交配期是頭足類繁殖行為的重要時期, 時間相對短暫, 卻具有復雜的求偶、交配和繁殖策略, 體現了無脊椎動物交配系統和性別決定體系的進化趨勢(Hanlon et al,1996)。動物的一雌多雄交配體系, 又稱多父本婚配(polyandry), 能夠為子代提供諸多的遺傳效益(Neff et al, 2005), 顯著影響有效種群數量(Karl, 2008), 對于母本的諸多益處主要表現在精子充足, 由于精子競爭而產生更優質后代、獲得更優基因以及保障子代具有較高變異以適應環境變化等(Uller et al, 2008)。Sugg等(1994)證實多雄交配模式使參與繁殖的有效雄性數量達到最大化, 從而減緩遺傳變異衰退速度,保持物種遺傳多樣性。Martinez等(2000)研究表明大西洋鮭的多雄交配模式顯著增加了有效群體大小, 防止了近交的快速積累。多父本婚配對種群遺傳多樣性的積極貢獻在更多海洋貝類中得到證實(Paterson et al,2001; Brante et al, 2011; Lombardo et al, 2012; Xue et al,2014; 楊智鵬等, 2015)。由此可見, 動物的繁殖策略及方式在維護種群數量起到不可替代的作用。

鑒于此, 本文進行了金烏賊室內繁育, 觀察繁殖行為, 同時檢測精子多態性, 并通過微衛星 DNA標記技術對親體和幼體進行親權鑒定, 旨在確定金烏賊的繁殖模式, 在人工繁育中有效利用多父本交配的遺傳規律為漁業管理提供理論支持, 緩解由于過度捕撈帶來的資源枯竭。

1 材料與方法

1.1 成體及幼體樣本

2009 年 5—7 月, 在青島海域(35°N, 119°E)捕獲金烏賊親體 22只, 室內圓形水泥池中暫養促熟, 使其交配產卵, 根據形態學判定混養群體中雌性共有 4只(依照死亡先后順序編號為F1, F2, F8和F18; F1和F2采捕后不久死亡, 未產卵), 雄性18只, 共獲得受精卵1000余粒。受精卵于20—24°C水溫下培育, 經30d孵化獲得金烏賊幼體, 隨機選取87只幼體作為子一代, 將幼體置于 95%酒精中固定, 以備 DNA提取用于親子鑒定。

1.2 精莢采集

從F2個體口膜下方納精囊處(圖1b)取出粘連在上面的精莢 46個, 分別擠壓精莢, 將其中的精團放入1.5mL離心管, 提取DNA。

圖1 金烏賊交配Fig.1 Mating behavior of S. esculenta注: a. 頭對頭交配; b. 雌體口膜下方納精囊(黑色箭頭示)

1.3 DNA提取和擴增

采用CTAB法(Winnepenninckx et al, 1993)從0.1g金烏賊成體腕肌肉提取DNA; 幼體DNA采用Chelex法(Li Q et al, 2003)提取; 精莢DNA首先使用含1%二硫蘇糖醇(DTT)和PK酶的SDS緩沖液消化(Carter et al,2000), 再按照 CTAB法提取 DNA。微衛星引物選取Zheng等(2007)的 8個位點(編號為 DQ656584,DQ656585, DQ656587—DQ656591, DQ656594)。PCR產物用 6%變性 PAGE電泳, 銀染顯色, 冰醋酸固定,烘干以讀取數據。

1.4 數據分析

精團DNA用8對微衛星引物進行擴增, PCR反應產物通過PAGE電泳展現。最后對比得出與雌性交配的雄性的微衛星片段長度, 一個位點如果發現二個以上不同長度的微衛星片段, 那么就有至少2個雄性金烏賊參與了雌性金烏賊的交配, 從而確定金烏賊的交配方式上是否存在一雌多雄。

同時, 通過相同的引物對金烏賊親本和幼體DNA模板進行PCR擴增, 擴增產物通過PAGE展現,比對幼體和親本微衛星 DNA片段長度確定親本, 從而判定在受精過程中是否存在一雌多雄現象。

以分子量標記物Marker (10bp DNA Ladder)為標準, 利用Labwork4.5軟件(Kumar et al, 2004)完成擴增片段大小和基因型讀取。

2 結果與分析

2.1 親權鑒定

根據繁殖行為學觀察得知, 其中 42個幼體的母本是F8個體。通過對8個位點的微衛星片段長度對比, 發現其潛在的父本是 M4和 M5(表 1)。32個幼體是由M4受精的, 占總幼體數的76.2%, 另外10個幼體是由M5受精的, 占總幼體數的23.8%(圖 2), 兩個雄性均在交配結束后死亡。另外45個幼體的母本是F18。通過對各個位點的微衛星片段長度進行對比,發現潛在父本是M12和M13(表 1)。28個幼體是由M12受精的, 占總幼體數的62.2%; 另外17個幼體是由M13受精的, 占總幼體數的37.8%(圖2), 兩個雄性均在交配結束后死亡。F18產卵孵化出的幼體中, 在Secu75、Secu113兩個位點, 還發現除M12和M13以外的其他等位基因(“？”表示, 占總幼體數的2%), 表明可能還存在其他潛在的父本, 由此確定金烏賊在受精過程中存在一雌多雄現象(圖2)。

圖2 幼體來自不同受精雄性及在總數中所占比例Fig.2 The rates of offsprings fathered by alternative males

表1 金烏賊潛在父本在8個位點基因型Tab.1 The genotypes of putative possible males for 8 loci in the population of S. esculenta

2.2 精子DNA微衛星分析

采用8個微衛星DNA位點對精莢DNA進行PCR反應, 發現每個位點存在3個等位基因, 表明F8個體與多個雄性交配, 每次交配的精子會儲存在納精囊中, 確定金烏賊在交配方式上存在一雌多雄現象。

3 討論

3.1 金烏賊繁殖模式

一雌多雄的交配現象在頭足類比較常見, 如槍魷類的 Loligo bleekeri, L. vulgaris, L. reynaudi, L.pealeii通常與多個雄性進行交配, 導致多重親子關系(Buresch et al, 2001; Shaw et al, 2004; Iwata et al,2005)。在無針烏賊Sepiella japonica中也發現了雌性和多個雄性進行交配的現象(Wada et al, 2006)。雖然Wada等(2005)證實金烏賊在繁殖期, 雄性和雌性都與兩個及兩個以上的異性交配, 存在“多夫多妻制”,但其實驗結果來自行為學觀察, 而本實驗通過 DNA分子標記技術從親子鑒定和精子多態性檢測兩方面相互驗證了金烏賊的交配模式。由精子多態性檢測結果可知, 雌性獲得的精子來自于非單一雄性個體,F18產卵孵化出的幼體中, 在 Secu75、Secu113兩個位點, 還發現了除M12、M13以外的其他等位基因(表1), 可能還存在第三個潛在的父本, 這與 Naud等(2005)從精子多態性角度揭示了澳洲烏賊S.apama與2—5個雄性個體交配的實驗結果相吻合, 也說明了從精子探索其交配模式的可行性。實驗過程中, 我們觀察到金烏賊“頭對頭”交配方式(圖 1a), 交配過程中靜止不動, 持續時間大約2min 43s, Arakawa(1960)等人也觀察到金烏賊以“頭對頭”方式觸腕相互纏繞交配, 整個過程持續超過 2min, 除此之外, “頭對頭”交配方式在無針烏賊S. japonica (Wada et al, 2006)和烏賊S. officinalis (Hanlon et al, 1999)中也可見到, 但后者交配可持續 10min。實驗記錄時, 我們根據父本死亡時間先后順序編號, M4和 M5是 F8子代的父本,M12和M13是F18子代的父本, M4、M5和M12、M13分別是緊緊相鄰的參與交配受精的雄性, 觀察發現M4、M5; M12、M13的死亡時間臨近(M4和M12的死亡時間分別早于 M5和 M13), 由此推測雌性金烏賊接受交配的時間短暫并且集中。

3.2 精子競爭行為

實驗結果顯示, 相對于M5和M13, M4 (76.2%子代的父本)和M12 (62.2%子代的父本)(圖2)擁有更多的子代, 暗示參與受精的精子大部分來自于 M4和M12,這可能與精子競爭行為有關。所謂“精子競爭”,即兩個及兩個以上的雄性的精子爭取和同一卵子受精(Siva-Jothy, 2002), 精子競爭行為與很多生物學因素相關聯, 如: 繁殖行為、進化、行為生理學, 其實質上是一種行為學現象, 是一種用來保證自己精子高受精率的繁殖策略(Hanlon et al, 1998)。精子替代是金烏賊的主要精子競爭行為, Wada等(2005)室內觀察到金烏賊交配前使用第三對腕刮去雌性口膜納精囊處精子的行為, 但不同于 S. officinalis (Boal, 1997;Hanlon et al, 1999)和 S. apama (Hall et al, 2002)通過漏斗噴水沖洗殘留的精子。S. japonica也習慣在受精之前用右四腕移除口膜附近的精子, 但其移除時間比其他烏賊要短(Wada et al, 2006)。盡管精子移除能夠有效的降低精子競爭, 但還是存在大量未除凈的精團, 表明精子移除是不徹底的(Wada et al, 2005),物種選擇完全或部分移除精子依靠生物和生態變量,比如納精囊的形態學結構和與雌性的交配時間(Simmons et al, 1998), 金烏賊的精子移除之所以時間短、不完全, 很可能與其爭取更多的交配時間、避免競爭者打斷交配有關。

當前實驗雖沒能觀察到雄性移除精子的行為,但交配完的雄性沒有馬上離開, 而是逗留在雌性旁邊, 直到雌性產完卵后才離開, 這屬于交配后對雌性的臨時保護, 有利于阻止其他雄性接近, 同時在保護期間通過多次重復交配增加自身精子儲存在雌體的概率, 有效提高受精率(Hall et al, 2002)。雖然有關昆蟲精子替代的實驗結果表明, 最后與雌性交配的雄性是絕大多數后代的父本, 即“后進先出”原則(Waage, 1979; Simmons et al, 1998), 但是烏賊類精子替代效應尚不清楚。本實驗中, 雖然 M4(M12)先于M5(M13)與 F8(F18)完成交配, 但前者擁有更多的子代(圖 2), 這并不遵循“后進先出”原則, 其主要原因可能是雄性在轉移精子至雌性納精囊處, 即刻成功完成受精, 大大降低后來競爭者的影響(Wada et al,2005)。除了常見的精子替代行為, Norman等(1999)還觀察到一種很有趣的精子競爭現象, 個體小的雄性澳洲烏賊偽裝成雌性, 一方面避免參與交配雄性的攻擊, 另一方面可以趁外來競爭者來襲時趁機與個體較大的雌性交配, 以獲得有效的交配機會。

3.3 雌性選擇行為

雌性的選擇行為主要包括對雄性和精子的選擇,雌性烏賊通過嗅覺暗示來選擇雄性個體, 或用噴水、噴墨離開的方式直接拒絕想要接近的雄性(Boal,1997; Boal et al, 1999)。本實驗中, 雌性金烏賊選取參與受精的精子均來自納精囊(圖 1), 這與雌性更傾向于利用納精囊精子有關(Naud et al, 2005; Wada et al,2005)。Naud等(2005)指出澳洲烏賊利用納精囊精子(首先被利用)的頻率是體內受精囊精子的 4倍, 這一選擇與這兩個儲精點的結構和位置有關, 納精囊位分布于口腔邊緣, 較容易利用, 而體內受精囊內的精子利用時須通過孔射出體外, 但當納精囊精子的數量較低時, 受精囊內的精子將會被利用。另外, 雌性隱秘選擇也具有重要作用(Xue et al, 2014)。

4 結論

本研究首次通過 DNA微衛星標記技術, 從分子水平上探索了金烏賊的繁殖模式。精子多態性和親權鑒定結果顯示, 金烏賊的交配模式存在一雌多雄。無論是精子競爭還是雌性選擇行為, 都是為了豐富金烏賊多雄的交配模式, 其目的是能獲得高質量的可育子代, 從而保證種群的結構穩定和遺傳多樣性。因此, 金烏賊存在一雌多雄的交配模式對保持種群的基因多樣性具有促進作用, 較高的等位基因遺傳多樣性對種群結構和數量必將起到積極作用(Buresch et al, 2001)。同時, 高頻率的多重親子關系能夠有效增加種群的規模和數量, 為數量處于變動中的種群保持一個高水平的基因多樣性水平(Zane et al, 1999)。金烏賊種群由于漁業壓力和環境因素的影響, 其種群數量處于不斷的變動中, 一雌多雄的繁殖模式是對進化、環境壓力的適應, 對于確保種群數量和多樣性水平起到關鍵作用。此外，金烏賊種群中是否存在多雌多雄繁育行為，需要進一步觀察和驗證。

致謝 青島膠南市海洋與漁業局王承彬副局長在實驗場地方面提供了便利, 中國科學院海洋研究所薛東秀博士對本文提出了寶貴意見和建議, 中國海洋大學水產學院錢耀森碩士參與了部分實驗工作,謹致謝忱。

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