環境光色對白條雙鋸魚(Amphiprion frenatus)幼魚生長和體色的影響*

馬本賀 孫志賓 馬愛軍① 于 宏 李偉業 徐志進王 婷 孫建華 夏丹丹

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室 青島 266071; 2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306; 3. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266071; 4. 浙江省舟山市水產研究所 舟山 316111)

白條雙鋸魚(Amphiprion frenatus), 隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes), 輻鰭亞綱(Actinopterygii), 鱸形目(Perciformes), 雀鯛科(Pomacentridae), 海葵魚亞科(Amphiprioninae), 雙鋸魚屬(Amphiprion), 主要分布在太平洋、紅海、印度洋等淺海海域。白條雙鋸魚俗稱“紅小丑”, 是最常見的海水性觀賞魚類, 因體色與紅番茄相似, 在歐美地區也被稱“番茄小丑”, 因其美麗的外觀和較容易飼養的生活習性受到眾多海水水族愛好者的青睞。

體型和體色是衡量觀賞魚觀賞價值和市場價格的重要因素, 改善體色是觀賞魚養殖中的一項主要目標。觀賞魚的體色主要由類胡蘿卜素和黑色素決定,黑色素存在于黑色素細胞中, 包括真黑色素和褪黑色素兩種, 由體內酪氨酸酶調控產生。動物自身無法合成類胡蘿卜素, 只能靠攝入含有類胡蘿卜素的食物來維持機體需要的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素是一類由碳氫鏈組成的烯烴化合物, 按照分子組成, 類胡蘿卜素分為兩類, 分別是含氧的葉黃素和不含氧的胡蘿卜素。魚類的體色和遺傳、環境、營養等因素均有密切關系。國內外對觀賞魚的體色研究較多,包括魚類體色改變機理以及改善方法等。Ho等(2013)研究了膳食中添加酯化蝦青素對公子小丑魚(Amphiprion ocellaris)色素聚集、類胡蘿卜素積累的變化, 以及類胡蘿卜素的各組成成分在公子小丑魚皮膚中隨時間變化的影響。陳超等(2014)研究了工廠化養殖模式下豹紋鰓棘鱸(Plectropomus leopardus)的早期色素轉變過程, 并觀察了螺旋藻粉和蝦青素兩種添加劑對其幼魚生長和體色變化的影響。Ueshima等(1998)通過對孔雀魚(Poecilia reticulata)皮膚色素細胞的相撞雜交試驗, 結果表明黑色素細胞內黑色素受等位基因B和b控制。光照作為一種重要的生態因子, 對養殖魚類的攝食、運動、代謝、生長、繁殖等一系列的生理生態都有著舉足輕重的影響作用。不同生態習性的魚類對光照的敏感性不同, 根據魚類感光的界限, 可以把光照趨于分為不良感光區、良好感光區、微弱感光區和不感光區四個部分。光照對養殖魚類的影響主要表現在光照強度、光色和光照周期(Owen et al, 2010)。促進魚類養殖健康高效的運行, 前提是必須了解養殖魚類對光照的適宜范圍, 探究養殖魚類的最適光照環境在實際生產中有著至關重要的積極意義。目前尚未見有關不同色光對白條雙鋸魚影響的研究報道。本試驗通過研究不同顏色光照對白條雙鋸魚幼魚生長和體色的影響, 以期為白條雙鋸魚的健康的人工養殖環境提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗所用白條雙鋸魚幼魚來源于舟山市水產研究所科研基地, 于1000L圓桶中暫養一周, 挑選體重(0.7353±0.1245)g、全長(3.569±0.2995)cm 的幼魚 150尾, 體型相似、體表無傷痕、攝食及活動正常。

1.2 試驗方法

在循環水養殖條件下, 試驗設置紅色、黃色、藍色、綠色、白色五個光照組(表 1), 每組三個重復。紅色、黃色、藍色、綠色為試驗組, 白色光為對照組。在室內長方形玻璃缸(80cm×50cm×40cm)中進行, 玻璃缸四周用厚遮光紙遮光處理, 上面用硬紙板蓋住。每缸內壁貼附三盞3W的 Led射燈。經照度計測量,在中午 12:00, 玻璃缸遮光處理后, 黑暗環境下缸內照度≤10 lx。

1.3 飼養管理

試驗開始時, 將150尾規格整齊的白條雙鋸魚幼魚平均分到15個養殖玻璃缸中(圖1)。預實驗7d, 試驗120d。試驗期間水溫26—28, ℃鹽度27—29, pH 8.0—8.4, 溶氧≥6mg/L, 氨氮＜0.2mg/L。光照周期為14L : 10D, 光照時間為6:00—20:00; 每天喂食四次,投餌時間分別為: 7:00、10:00、14:00、17:00。11:00和 18:00虹吸殘餌糞便, 并加入等量備好的海水, 養殖器具在使用前后消毒清潔。除光照外其他因素保持一致, 每日觀察試驗的攝食及活動狀況。

表1 光照試驗組Tab.1 The experiment groups of light type

圖1 循環水養殖系統模式圖Fig.1 Schematic diagram of recirculating aquaculture system

1.4 樣品采集與測定

試驗結束時, 試驗魚空腹24h后稱取重量。每組選取6尾中等體型、健壯活潑的試驗魚, 在冰盤中解剖分別取得紅色皮膚(背部)、白色皮膚、肌肉、眼睛、肝臟各組織, 分別稱重后放入 1.5mL離心管, 一份加入9倍質量體積比的PBS (pH 7.4), 另一份不作處理,兩份樣品用液氮迅速冷凍后放入–80℃冰箱保存待測。

1.5 指標測定及方法

1.5.1 生長性能指標

存活率=實驗結束時魚尾數/實驗開始時魚尾數×100%;

增重率= (末體質量–初始體質量)/初始體質量×100%;

特定生長率= (ln末體質量–ln初始體質量)/試驗天數×100%;

1.5.2 胡蘿卜素含量的測定 應用雙抗體夾心法,使用魚胡蘿卜素酶聯免疫分析試劑盒測定胡蘿卜素含量。用純化的魚胡蘿卜素抗體包被微孔板, 形成固相抗體, 將含有胡蘿卜素的樣品依次加入包被單抗的微孔中與辣根過氧化物酶(HRP)標記的胡蘿卜素抗體結合, 形成抗體-抗原-酶標抗體復合物, 溫育結束用洗滌液徹底洗凈后加底物三甲基硼(TMB)顯色。三甲基硼(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)的催化作用下轉變成藍色, 最后在酸的作用下轉變成黃色。溶液顏色的深淺和樣品中的胡蘿卜素含量呈正相關關系。

加入PBS的冷凍樣品取出融化后, 再加入10倍質量體積比的PBS (pH 7.4), 冰浴勻漿充分后, 低溫離心20min (3500r/min), 仔細收集上清液, 以上操作均在冰板上進行。按照試劑盒說明書步驟進行操作,使用酶標儀在 450nm處測定吸光度 OD值。以標準物的濃度為橫坐標, OD值為縱坐標繪出標準曲線,由標準曲線計算出樣品的胡蘿卜素濃度。

1.5.3 葉黃素含量的測定 使用魚葉黃素(Lutein)酶聯免疫分析試劑盒測定葉黃素含量。按照試劑盒說明書步驟進行操作, 使用酶標儀在450nm處測定OD值。以標準物的濃度為橫坐標, OD值為縱坐標繪出標準曲線, 由標準曲線計算出樣品的葉黃素濃度。

1.5.4 酪氨酸酶活性的測定 取出直接冷凍的組織, 在室溫下加入5.0mL的PBS (pH=6.8), 冰浴勻漿充分后低溫離心25min (8000r/min), 取上清液作為酪氨酸酶粗提液。酪氨酸酶活性測定參照丁玉庭等(1999)的測定方法并略作修改: 在2.5mL測活體系中,先加入剛配制的 0.5mL 3mg/L的 L-DOPA, 再加入28℃預熱的酪氨酸酶粗提液2.0mL。混合后立即用紫外分光光度計于475nm處測定吸光度OD0值, 10min后再次測定各樣品的OD10值。

酪氨酸酶活力計算公式:

其中, V為樣品體積(mL); T為時間(min)

1.6 數據處理

采用SPSS20.0軟件和Microsoft Excel對實驗數據進行統計學分析, 結果數值采用“Means±SD”表示,先對數據作單因素方差分析(one-way ANOVA), 組間若有顯著差異, 再做 Duncan’s多重比較, P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 光色對白條雙鋸魚幼魚生長的影響

2.1.1 光色對白條雙鋸魚末重的影響 試驗結束時, 各光照組試驗魚最終體重均有不同程度的增加,各組體重紅光組＞黃光組＞白光組＞藍光組＞綠光組。組間試驗魚最終體重差異顯著(P＜0.05)。紅光組體重最大, 顯著高于藍光組、綠光組(P＜0.05)。在黃光、藍光、綠光和白光各組間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.1.2 光色對白條雙鋸魚存活率的影響 由圖 3可知, 五組試驗魚成活率均在90%以上, 各組試驗魚成活率不盡相同, 組間白條雙鋸魚存活率差異不顯著(P＞0.05)。根據觀察, 在一個群體中, 體型瘦小的小丑魚偶爾受到雌魚的追咬, 造成體表傷痕、行動遲緩、背鰭和尾鰭的殘缺, 影響正常攝食和生長, 并在一段時間后死去。這種由于小丑魚群體生活習性導致的致死, 認為與光照因素無直接關系。白條雙鋸魚幼魚在紅色、黃色、藍色、綠色、白色五種光照下均能生存, 光色對白條雙鋸魚的存活沒有顯著影響(P＞0.05)。

圖2 不同處理組試驗魚最終體重Fig.2 The final weight of different lights in trial fish

圖3 不同光色對試驗魚存活率的影響Fig.3 The effects of different light colors on survival rate of trial fish

2.1.3 光色對白條雙鋸魚增重率的影響 如圖 4,根據試驗結果顯示: 紅光組白條雙鋸魚增重率最大,綠光組增重率最小, 增重率由大到小排列順序為: 紅光組＞黃光組＞白光組＞藍光組＞綠光組。紅光組、黃光組和白光組增重率分別顯著大于藍光組、綠光組(P＜0.05)。紅光對白條雙鋸魚增重率影響最大, 紅光組增重率比藍光組顯著提高 16.96%, 比綠光組顯著提高 19.94%; 比黃光組、白光組分別提高 9.14%、8.05%, 差異不顯著(P＞0.05)。黃光組增重率白光組低1.01%, 兩組增重率接近。藍光、綠光組增重率分別顯著低于白光組(P＜0.05)。

2.1.4 光色對白條雙鋸魚特定生長率的影響 光色對白條雙鋸魚特定生長率的影響如圖5所示。五組試驗魚特定生長率分別為紅光組(0.87±0.05)%/d、黃光組(0.82±0.04)%/d、藍光組(0.78±0.04)%/d、綠光組(0.82±0.10)%/d、白光組(0.83±0.04)%/d。紅光組特定生長率最大, 高于白光組, 其余組均低于白光組; 藍光組特定生長率最小。各試驗魚組間特定生長率差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 不同光色對試驗魚增重率的影響Fig.4 The effects of different light colors on weight gain rate of trial fish

2.2 光色對眼斑雙鋸魚幼魚體色的影響

2.2.1 光色對白條雙鋸魚胡蘿卜素含量的影響實驗結束時, 各試驗組白條雙鋸魚紅皮、白皮、眼睛、肌肉、肝臟中胡蘿卜素平均含量見表2。對紅皮中胡蘿卜素含量而言, 紅光組顯著高于黃光、藍光、綠光三個組(P＜0.05); 與白光組差異不顯著(P＞0.05); 黃光組和綠光組與白光組無顯著性差異(P＞0.05); 藍光組顯著低于白光組(P＞0.05)。白皮中胡蘿卜素含量白光組最高, 紅光組略低, 綠光組最低; 各組間差異不顯著(P＞0.05)。眼睛中胡蘿卜素含量從高到低依次為白光組、紅光組、藍光組、黃光組、綠光組; 組間差異不顯著(P＞0.05)。肝臟中胡蘿卜素含量各組間差異不顯著(P＞0.05), 紅光組最高, 黃光組次之; 藍光組、綠光組和白光組三組之間大約持平。肌肉中胡蘿卜素含量藍光組最高, 綠光組最低; 組間差異不顯著(P＞0.05)。

圖5 不同光色對試驗魚特定生長率的影響Fig.5 The effects of different light colors on specific growth rate of trial fish

表2 光色對試驗魚胡蘿卜素含量的影響(ng/g)Tab.2 The effects of different light colors on carotene of trial fish (ng/g)

2.2.2 光色對白條雙鋸魚幼魚葉黃素含量的影響 根據表3所示結果顯示。紅皮中葉黃素含量在黃光組最高,達到(1.25±0.29)ng/g, 在白光組最低, 含量為(1.17±0.23)ng/g。白光組的白皮中葉黃素含量高于其他光照組白皮中葉黃素含量。眼睛中葉黃素含量黃光組最高, 藍光組最低。肝臟中葉黃素含量各試驗組基本持平。肌肉中葉黃素含量: 白光組＞黃光組＞紅光組＞藍光組＞綠光組。在本試驗中光色對白條雙鋸魚葉黃素含量無顯著性影響(P＞0.05)。

2.2.3 光色對白條雙鋸魚幼魚酪氨酸酶活性的影響各組試驗魚酪氨酸酶活性的差異見表4。在皮膚、眼睛、肌肉組織中, 各試驗組間酪氨酸酶活性無顯著性差異(P＞0.05)。在肝臟中, 白光組酪氨酸酶活性最高(22.23±2.18)U/mL, 最低為紅光組的(18.18±2.03)U/mL,比白光組顯著降低 22.3%(P＜0.05); 其他組之間無顯著性差異(P＞0.05)。光色對試驗組間不同組織酪氨酸酶活性的影響不同。

表3 光色對試驗魚葉黃素含量的影響(ng/g)Tab.3 The effects of different light colors on lutein content of trial fish (ng/g)

表4 光色對試驗魚酪氨酸酶活性的影響(U/mL)Tab.4 The effects of different light colors on tyrosinase activity of trial fish (U/mL)

3 討論

3.1 光色對白條雙鋸魚幼魚生長的影響

光色作為重要的環境因子, 對水生動物攝食、行為、生理生殖各方面有著重要的作用。不同單色光的中心波長不同, 按波長大小劃分順序依次為: 紅光＞橙光＞黃光＞綠光＞藍光＞紫光。其中紫色光波長短, 能級高, 不利于水生動物的正常生長發育。水生動物對光照環境做出的行為反應可概括為“趨光性”和“避光性”, 也稱為“正趨光性”和“負趨光性”。曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni)(王萍等, 2009)對紅光和綠光的趨光率明顯高于白光和橙光。刺參(Stichopus japonicus)(隋佳佳, 2008)對橙色、黃色光表現出正趨光性, 對藍色、綠色光表現出負趨光性; 在紅光照射下得特定生長率顯著高于綠色光照下(P＜0.05)。同一種類個體在不同的生長階段對光色的敏感性也有差別。龍蝦(Palinuridae)( Fanjul-Moles et al, 1992)具有兩套獨立的感光系統, 分別對應著短波感應和長波感應, 感光系統會隨著生長而發生變化, 導致在發育前期和發育后期對光色的選擇性不同。在不同密度下, 養殖對象對光色的適應性也有所改變。Karakatsouli等(2010)發現在鱗鯉(Cyprinus carpio)的循環水養殖模式下,紅光對低密度養殖有利, 藍光則有助于高密度養殖。在自然光、黃光、藍光、綠光四種環境中, 中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)在自然光下特定生長率最大; 在藍光下攝食率最大, 但是特定生長率最小;王芳(2004)認為中國明對蝦在藍光下食物轉化效率低下, 加之大部分的能量通過動能消耗導致了生長速度顯著低于其他試驗組。

試驗魚在不同光色環境中的反應不同, 在初次光照時應激反應最為明顯。白光組試驗魚多聚集在中下層或底層游動, 遠離光源; 紅光下試驗魚的反應和白光組相似; 藍光組和綠光組試驗魚大部分在中上層聚集; 黃光組試驗魚分布比較均勻, 無明顯聚群現象。經過數小時后, 各組試驗魚對光照的反應逐漸減弱, 直至消失。試驗結果表明白條雙鋸魚在不同顏色光照下均能保持較高的存活率。光色對增重率有重要影響, 適當的紅色光照可以促進增重率的提高。各試驗組中紅光組試驗魚特定生長率最大, 高于自然光照組; 藍光組試驗魚的特定生長率最低。本試驗中特定生長率各組間無顯著性差異(P＞0.05), 這可能與白條雙鋸魚特殊的生態習性有關, 在一個群體中個體強壯的兩條幼魚分別迅速發育為雌魚和雄魚, 性別分化的親魚會抑制群體中其他魚類的生長發育, 導致各組試驗魚的特定生長率相似。相比較而言, 白條雙鋸魚幼魚在紅光中更有宜于生長。

3.2 光色對白條雙鋸魚幼魚體色的影響

體色對于水生動物捕食、求偶、偽裝、警戒、調節等有重要的作用( Sk?ld et al, 2013)。魚類體色由色素細胞和色素含量決定, 控制體色的因素分為內源性因素和外源性因素兩大類。水產動物體色變化分為形態學變化和生理學變化。水產動物體表色素主要由黑色素和類胡蘿卜素構成, 黑色素的生物合成是由酪氨酸酶催化體內酪氨酸羥化而啟動的一系列生化反應過程, 酪氨酸酶活性是黑色素生成能力的間接反映。類胡蘿卜素則通過攝食積累在體內, 魚類對類胡蘿卜素的代謝有兩種類型。投喂增色飼料可以在不同程度上改善魚類體色。用添加蝦青素的飼料投喂虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Nickell et al, 1998)可使其肌肉中類胡蘿卜素含量顯著高于普通飼料組。劉浩亮(2013)通過對紅羅非魚(Red Tilmpa)投喂不同增色飼料發現不同的添加劑對組間試驗魚體色的影響效果差異顯著; 組內試驗魚類胡蘿卜素含量和酪氨酸酶活性具有組織差異性; 紅羅非魚皮膚中類胡蘿卜素和酪氨酸酶活性呈負相關關系。Ho等(2013)對一月齡公子小丑魚幼魚每天投喂含有不同濃度蝦青素的飼料, 蝦青素的濃度依次為: 40、60、80、160mg/kg, 飼養90d后發現投喂80和160mg/kg蝦青素飼料的試驗魚比投喂低含量蝦青素飼料的試驗魚在體色上有顯著改善。周邦維(2014)研究了豹紋鰓棘鱸在紅光、藍光、全黑暗和晝夜光四種光照下皮膚色素的變化, 發現該魚皮膚中胡蘿卜素含量、葉黃素含量、黑色素含量均在晝夜光中達到最高, 并且黑色素含量和胡蘿卜素含量出現同幅增減的關系。本試驗中白條雙鋸魚皮膚中胡蘿卜素在紅光中含量高于其他光照組; 葉黃素含量酪氨酸酶活性在各組間差異不顯著。組內不同組織間色素沉積和酪氨酸酶活性差異顯著。光色對魚類色素的影響是一個緩慢的過程, 其調控機制有待進一步研究。在本試驗中, 紅光能促進白條雙鋸魚類胡蘿卜素在體內的累積, 有利于體色的改善。

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