牛欄山二鍋頭釀造過程中的真菌多樣性分析

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(1.北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠,北京 101301;2.中國科學院微生物研究所,真菌學國家重點實驗室,北京 100101)

清香型白酒是我國最古老的酒種之一,具有清香純正,醇甜柔和,自然諧調,余味爽凈的特點[1]。牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒,其釀造過程是開放式的多菌種固態發酵方式,以高梁等谷物為原料,大曲為糖化發酵劑,采用清蒸清茬釀造工藝、固態地缸發酵、清蒸流酒[2]。開放式的釀造過程有助于其網羅自然界的多種微生物,這些微生物在釀造過程中繁衍、代謝,形成了屬于牛欄山二鍋頭的獨特風味。

真菌類微生物是白酒釀造中不可或缺的一類微生物,其在釀造過程中主要可分為絲狀真菌和酵母菌兩大類。目前普遍認為,絲狀真菌是釀酒生產前期發酵原料中所含有的淀粉等大分子物質降解的主要動力,其分解后的產物可被其他微生物所利用,對產酒、產香存在促進作用,同時絲狀真菌在生長代謝過程中會生成一些呈香物質,對風味的形成做出貢獻[3-5]。酵母菌則被認為是發酵前期產酒、生香的主力菌,在發酵過程中,酵母菌可以產生酒化酶作用于葡萄糖,通過糖酵解和丙酮酸無氧降解過程生成乙醇,其所分泌的酯化酶又能利用酒醅環境中的乙醇、酸等底物通過酯化過程合成多種風味物質[6-9]?？梢钥闯?真菌微生物在白酒發酵中涵蓋了糖化、產酒、生香這幾個重要過程,所以對白酒釀造中真菌微生物進行研究有助于我們系統的解析白酒釀造過程。

傳統微生物分離是白酒微生物研究中較為常用的技術手段,它主要適用于發酵中可培養類微生物,可以有效地確定微生物的變化規律并獲得活體菌株。高通量測序技術可以對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析,可以快捷方便的讀取樣品中復雜的微生物結構,具有明顯的先進性和優勢,是分析復雜多菌種樣品的首選方法[10]。目前,高通量測序技術已經運用于各種分子生物學領域,包括人體微生物研究方面、水中生物、土壤微生物群落研究等[11-12]。

本文利用傳統微生物分離方法和高通量測序技術,分析了牛欄山二鍋頭發酵過程中真菌的演替規律。將兩種方法結果相結合,確定了發酵過程中真菌的變化規律及優勢微生物,為清香型白酒優良真菌微生物的篩選及其功能性研究提供指導。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

冬季大茬發酵酒醅(第一次入缸發酵的高粱) 牛欄山酒廠;氯仿、異戊醇、異丙醇均為分析純 購于上海生工生物工程有限公司;YPD培養基:酵母浸粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 L;PDA培養基:馬鈴薯浸提液500 mL,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水500 mL;孟加拉紅培養基、察氏培養基 北京奧博星生物技術有限公司;FastDNA SPIN Kit for Soil(MP bio土壤基因組DNA提取試劑盒) 北京比特博生物技術有限公司。

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;快速梯度基因擴增儀(梯度C1000)、基礎型水平電泳儀 美國BIORAD公司;全自動凝膠成像儀 美國BIORAD公司;1-14k高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;SPX-320型生化培養箱 寧波江南;DW-86L828W冷水之星 海爾超低溫冰箱;樣品快速制備系統 美國MP FastPrep-24。

1.2實驗方法

1.2.1 發酵酒醅真菌分離 取樣:根據大茬發酵溫度曲線特點,從整個發酵周期28 d中確定七個時間點采集樣品,分別為0、3、7、13、19、23、28 d,選取同批次發酵的三缸作為取樣缸(平行對照),取樣位置為地缸中心點距地缸表面60 cm處,樣品編號為D3A、D3B、D3C其余取樣點以此類推(入池0 d初始樣品,只取一份即可)。

分離:稱取發酵酒醅樣品10 g于90 mL無菌水稀釋,擬定為10-1梯度。依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5梯度,分別吸取10-3、10-4、10-5梯度稀釋液0.1 mL,涂布于相應分離篩選培養基平板上。

培養:將涂布分離好的平皿按照常規培養法培養,培養的微生物包括絲狀真菌、酵母菌。培養溫度分別為絲狀真菌30 ℃、酵母28 ℃,培養時間根據菌落的生長情況而定,一般為24～48 h[13]。

計數及挑菌:根據選擇培養的結果,酵母菌以10-4板,絲狀真菌以10-3板為主計數。根據絲狀真菌和酵母菌形態差異,將不同形態真菌分類別單獨挑取計數[14-15],采用PCR隨機鑒定20～30株,確定該類別酵母準確分類,并根據稀釋倍數計算不同微生物的種群數量。其余梯度每個平板挑取不同形態的單菌落,接種在斜面上28 ℃培養2 d,挑取新鮮的純菌接種至20%無菌甘油管-80 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2.2 真菌PCR擴增及測序

1.2.2.1 酵母DNA提取方法 接取少量活化的菌體,于1.5 mL離心管內;加入100 μL裂解液(100 mmol/L Tris,30 mmol/L EDTA,0.5% SDS,pH8.0,115 ℃滅菌30 min備用);100 ℃水浴15 min;加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸鉀溶液,冰浴60 min;4 ℃下12000×g離心5 min,取上清液200 μL至0.5 mL離心管中;加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1),劇烈振蕩10 min,12000×g離心15 min,移取100 μL上清液至0.5 mL離心管中;加入100 μL預冷的異丙醇,混勻后-20 ℃下放置20 min;12000×g離心15 min,棄去上清;用70%的酒精洗滌沉淀兩次;沉淀過夜自然干燥;加入50 μL已滅菌的超純水,室溫下溶解1 h,-20 ℃冰箱儲藏備用[16-17]。

1.2.2.2 絲狀真菌DNA提取方法 采用土壤基因組DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for SoiL試劑盒提取。

1.2.2.3 PCR擴增及鑒定 對所提取的真菌DNA進行26S rDNA D1/D2區和ITS區片段擴增,酵母菌采用通用引物NL1/NL4,絲狀真菌采用通用引物ITS5/ITS4,如表1所示。

PCR反應條件:94 ℃加熱3 min使模板DNA變性,然后進入下列溫度循環:94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共進行35個循環,最后在72 ℃延伸5 min。

PCR產物送公司測序后,用Chromas軟件分析測序質量,去除峰圖不可靠的部分對DNA序列進行手動校正,用校正后的序列在NCBI(http://www.ncbi.nLm.nih.gov/bLast)中進行同源序列搜索。

表1 真菌PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence of fungi

1.2.3 大茬發酵酒醅高通量測序 稱取1 g不同發酵期酒醅樣品,經Fastprep處理后,采用土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for SoiL)提取總NDA。濃度檢測合格后,送北京奧維森公司對真菌Its1-Its2區行高通量測序,利用Illumina MiSeq PE300進行高通量測序得到原始測序序列,通過Fastqc進行質量檢測去除低質量Reads(過濾標準:Q20≥ 90%)。通過Cope軟件(Connecting Overlapped Pair-End,V1.2.3.3),進行序列拼接及過濾后利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法(Average Neighbor Clustering Algorithm)在0.03(或97%的相似度)水平下對Clean Tags進行OTU(OperationaL Taxonomic Units)的聚類,統計各個樣品每個OTU中的豐度信息。選取分析數據中每個OTU中一個有代表性的序列,通過BLast比對,獲得每一個OTU種名。將OTU按Reads數進行降序排列,選取數量前8 的OTU進行數據分析[18-19]。

2 結果與分析

2.1大茬發酵溫度曲線

從圖1可以看出大茬發酵溫度曲線呈現前緩升、中挺、后緩落的趨勢,是清香型白酒較為理想的升溫曲線,即發酵升溫應逐步上升,至主發酵期,溫度應穩定一個時期,隨后進入后發酵期,發酵溫度緩慢下降,直至出缸蒸餾[20]。發酵的0～9 d屬于溫度緩升期,緩慢升溫有利于控制酒醅生酸,維持正常發酵的進行;9～13 d屬于中挺階段,是主發酵期和后發酵期的交接期;13～28 d為后緩落期,該階段酒精發酵基本結束主要以產香為主[21]。本研究選取的7個取樣點分別涵蓋了發酵的3個階段,對整個發酵過程具有較好的代表性。

圖1 大茬發酵溫度及取樣點Fig.1 Fermentation temperature and sampling point of fermented grains

2.2大茬發酵真菌數量變化規律

本實驗中,根據真菌形態和PCR分類結果將發酵過程中真菌分為4大類,分別為:扣囊覆膜酵母、釀酒酵母、生香酵母(扣囊覆膜酵母和釀酒酵母之外的酵母菌)和絲狀真菌。通過圖2可以看出,在大茬發酵過程中,入池階段主要真菌是扣囊覆膜酵母和絲狀真菌,這兩類真菌在發酵前期數量較多,在7 d后數量開始減少,在13 d已經很難分離到;生香酵母在入池階段無法分離到,隨著發酵的進行數量開始快速增長,在發酵第7 d,數量達到頂峰(1.63 log cfu/g),隨后數量開始減少,在13 d后已經分離不到;釀酒酵母同樣在入池階段無法分離到,隨后開始快速增長,在13 d數量達到頂峰(7.55 log cfu/g),此時扣囊覆膜酵母、絲狀真菌和生香酵母在酒醅中已無法分離到,在發酵后期釀酒酵母數量出現下降趨勢,但在出池階段仍保持在5.5 log cfu/g;整體看來,釀酒酵母是大茬發酵中期和后期的主要真菌。

圖2 大茬發酵真菌數量變化Fig.2 Quantity changes of fungi in Dacha fermentation

2.3大茬發酵生香酵母和絲狀真菌種類變化圖

生香酵母在發酵過程中主要活躍在0～7 d,在入池階段和13 d無法分離到。在本次實驗中共分離到478株生香酵母,共分為10個種。通過圖3可以看出在生香酵母最為活躍的階段,主要種類是由畢赤類酵母組成,包括:Pichiakudriavzevii、Pichiafermentans、Pichiafarinosa,同時還含有一定量的TorulasporadeLbrueckii、Candidahumilis、Kazachstaniaservazzii及Wickerhamomycesanomalus,其余種類酵母相對較少。

圖3 大茬發酵生香酵母Fig.3 Aroma-producing yeasts of Dacha fermentation

由于絲狀真菌只存在發酵前期,且難以通過肉眼判斷其種類,所以將發酵前期所分離到的絲狀真菌共同分析。從0 d和7 d樣品中共分離到絲狀真菌5個種,共81株。其中Lichtheimiacorymbifera62株。其余Rhizopusarrhizus和Mucorcircinelloides等數量較少。可以看出L.corymbifera是發酵過程中主要絲狀真菌。

表2 大茬發酵絲狀真菌Table 2 Filamentous fungi of Dacha fermentation

2.4大茬酒醅高通量測序結果

本次高通量實驗中,共獲得143種真菌OTU,主要包括酵母目、毛霉目、散囊菌目和絲孢酵母目,挑選Reads數前8的OTU進行數據分析,分別為S.fibuligera、S.cerevisiae、Naumovozymacastellii、K.servazzii、C.humilis、P.kudriavzevii、Candidatropicalis和L.corymbifera。

如圖4所得,在0 d入池階段,上述8種真菌均能在酒醅中檢測到,其中S.fibuligera和P.kudriavzevii是主要真菌;在第3 d,S.fibuligera所占比例繼續增加,成為了酒醅中的主體真菌;第7 d,S.cerevisiae、Naumovozymacastellii、K.servazzii和C.humilis數量出現增長,S.fibuligera所占比例雖有下降,但仍為酒醅內主體真菌;隨著發酵的進行,在13 d頂火期S.fibuligera快速下降,S.cerevisiae成為發酵中的主體真菌,K.servazzii和C.humilis變化不大;在隨后19～28 d,雖然S.fibuligera、N.castellii和C.humilis數量稍有增長,但S.cerevisiae繼續保持較高的數量關系至出池,是頂火后期的主要真菌。

圖4 基于高通量測序結果的大茬酒醅真菌物種多樣性和演替Fig.4 Fungal diversity and succession in Dacha fermentation process based on high throughput sequencing of ITS libraries注：A、B、C分別表示同一取樣點平行樣品。

通過以上結果可以得出,酒醅發酵的0～7 d是溫度緩升階段,酒醅內真菌多樣性較為豐富,傳統分離方法表明該階段主要真菌包括S.fibuligera、S.cerevisiae、絲狀真菌類的L.corymbifera、R.arrhizus和生香酵母類的P.kudriavzevii、P.fermentans、P.farinosa,雖然生香酵母和S.cerevisiae在0 d后快速增長,但該階段的主體真菌為S.fibuligera和L.corymbifera。高通量測序結果同樣表明了S.fibuligera是發酵前期的主體真菌。在13 d頂火期～28 d發酵結束階段,傳統分離和高通量測序均表明S.cerevisiae為該階段的主體真菌。兩種分析手段共同確定了S.fibuligera和S.cerevisiae是牛欄山二鍋頭發酵前期和中后期的主要真菌,但在其余真菌數量關系上存在一定差異,如:傳統分離結果表明L.corymbifera同樣是發酵前期的主要真菌,而高通量測序結果中L.corymbifera在發酵前期所占比例較低;在發酵中后期,酒醅內已難以分離到S.cerevisiae以外的酵母,而高通量測序結果則依然表明在該階段酒醅中含有一定量的S.fibuligera、N.castellii和C.humilis。分析認為,在發酵過程中,酵母死亡后未降解DNA影響了高通量測序的比例關系,造成了傳統分離結果與高通量測序出現差異現象。

3 結論與討論

本文采用傳統分離方法結合26S rDNA D1/D2區和ITS區基因序列分析方法和高通量測序技術共同分析了牛欄山二鍋頭大茬發酵不同時期真菌多樣性組成。研究結果表明,發酵前期升溫階段是酒醅真菌多樣性較為豐富的時期,主要為S.fibuligera、S.cerevisiae和以L.corymbifera為主的絲狀真菌及以畢赤酵母為主的生香酵母,其中S.fibuligera和L.corymbifera是主體真菌,在發酵中期和后期,酒醅內已很難分離到除S.cerevisiae以外的真菌,S.cerevisiae則成為發酵后期的主體真菌。

本研究利用傳統分離技術結合高通量測序技術共同對大茬發酵真菌多樣性進行系統研究,有效的彌補了兩種分析方法的不足,如傳統的分離方法雖然可從酒醅中分離到活體微生物,但培養基的配制較難模擬出酒醅整體環境的復雜性,無法獲得準確微生物多樣性,而分子生態學技術僅集中于微生物結構的分析,雖然能夠全面地解析微生物多樣性,但由于其無法區分活體與死亡的微生物DNA片段,很容易造成結果與真實值出現偏差。采用兩種方法相結合可以較為準確的獲得發酵過程中真菌多樣性及變化規律,有助于我們解析發酵過程中不同真菌微生物的作用,為今后的強化添加、菌種篩選以及機械化生產提供理論支撐。

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