重組酶聚合酶擴增技術及其在病毒性豬病快速檢測中的應用

莊夕棟

（諸城市畜牧獸醫管理局，山東 諸城 262200）

重組酶聚合酶擴增（RPA）技術，是近幾年出現的有望替代PCR的新的核酸擴增技術。RPA技術由Piepenburg等[1]于2006年創立，該技術基于重組酶聚合酶介導的擴增原理，體外模擬生物體內DNA復制，在恒溫條件下即可對目的片段進行擴增[2]，特別適用于快速檢測，特別適用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域[3]，已被成功應用到多種病原的快速檢測上。本文現將RPA技術及其在病毒性豬病快速檢測中的最新應用綜述如下。

1 RPA技術

該技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶[4]。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37℃左右。反應過程中不需要模板鏈的熱變性，可以在恒定的低溫條件下10～20 min內快速擴增目的DNA或者RNA[5]。隨后，英國TwistDx公司開發出了商品化試劑盒，加快了RPA技術的研發、推廣和應用[6]。與傳統聚合酶鏈式反應（PCR）相比，PRA具有擴增速度快、反應溫度恒定、所需儀器簡單，檢測成本低、結果確實可靠，可制作成側流層析試紙條（LFD）等優點，適用于現場快速檢測，有望替代PCR。目前，RPA已經在病毒、衣原體、支原體、細菌、寄生蟲等病原檢測方面得到了開發與應用[7]。

2 RPA技術在病毒性豬病檢測中的應用

2.1 口蹄疫

口蹄疫（FMD）是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種偶蹄動物共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，被國際獸疫局（OIE）列為A類疾病。Abd等[8]將RPA基礎反應體系中加入反轉錄酶，在RPA基因擴增與熒光檢測儀中進行RT-RPA，應用到FMDV的檢測當中，可以檢測到FMDV的所有的7個血清型，而且各型之間沒有發生交叉反應，特異性強，靈敏性高。Amer等[9]研發出一種可以在4～10 min檢測到FMDV的實時RTRPA，靈敏度高達98%。此技術成功應用于當年埃及的口蹄疫大暴發時期，有效抑制了疫情的蔓延。王紅梅等[10]利用最新的RPA技術，結合LFD方法，建立了可用于O型、A型和AsiaⅠ型FMDV的通用型和血清型分型的現場快速檢測技術。在25 min內即可以完成RPA反應，靈敏度可達到1個TCID50。楊洋等[11]根據O型FMDV ON毒株3D基因保守區域設計引物和探針，建立了實時熒光反轉錄重組酶聚合酶擴增（real-time RT-RPA）檢測方法，在40 ℃恒溫條件下20 min內可快速、特異地檢測FMDV。利用該方法對采集的臨床樣品進行檢測，檢測結果與熒光定量RT-PCR檢測結果具有100%的符合率。RPA技術為FMDV的現場檢測提供了一種靈敏、可靠的新方法，為口蹄疫疫情的診斷及預報提供了技術支持。

2.2 豬細小病毒病

豬細小病毒（PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎兒死亡、重吸收、流產、木乃伊胎等，但母豬不表現明顯的癥狀。Yang等[12]研制了檢測PPV NS1基因的熒光定量RPA和LFD方法，最低可分別檢測到300和400個含NS1基因的重組質粒，平行檢測101份病料和27份陰性樣品，熒光定量RPA和LFD與熒光定量PCR結果符合率分別為94．4%和100%。

2.3 豬圓環病毒病

豬圓環病毒2型（PCV2）是引起仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）為代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周齡的仔豬。PCV2的感染呈世界性分布，已成為危害養豬業健康發展的重要病因之一。PCV2感染可以導致動物免疫抑制，從而增強對其他多種病原體的易感性，使病情更加復雜化。Wang等[13]建立了檢測PCV2的實時熒光定量RPA方法。該方法最低可檢測100個PCV2基因組，靈敏度與熒光定量PCR相同，較普通PCR提高了10倍。平行檢測48份病料樣品，RPA與熒光定量PCR結果一致，與普通PCR符合率為93．7%（45/48）。

2.4 豬藍耳病

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴重危害養豬業的傳染病，在世界范圍內的豬場廣泛流行，給養豬業造成了巨大經濟損失。Yang等[14]研制了檢測高致病性豬藍耳病病毒（HP-PRRSV）的熒光定量RPA方法。該方法最低可檢測到70個目的基因的重組質粒，平行檢測125份臨床樣品，熒光定量RPA與熒光定量PCR檢測結果敏感性和特異性分別為97．6%和100%。

2.5 豬流行性乙型腦炎

豬流行性乙型腦炎又名日本乙型腦炎，是由日本乙型腦炎病毒（JEV）引起的一種急性人獸共患傳染病。豬主要特征為高熱、流產、死胎和公豬睪丸炎。梁輝[15]建立了JEV的RT-RPA-LFD的快速檢測方法，20～25 min即可獲得穩定、準確的檢測結果，具有耗時短、操作簡便、結果判定準確直觀的優點，適合用于JEV現地檢測和在基層推廣應用。而且T-RPA-LFD檢測方法可以用于多種JEV分離株的檢測，方便攜帶，適用性強。

2.6 其他豬病

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發紺、內臟器官嚴重出血、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對養豬業危害巨大，是我國一類動物疫病和OIE規定的必須報告的動物疫病。王建昌等[16]基于ASFV VP72基因保守序列設計并合成引物，建立了ASFV的RPA檢測方法，在38℃水浴鍋中恒溫反應30 min，即可實現對目的片段的有效擴增，為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術支持。

塞尼卡谷病毒（ SVV）又稱為Senecavirus A（SVA），是豬原發性皰疹病（SIVD）的主要病原，可感染豬，引起類似FMDV感染造成的水皰性病變。SVV感染豬群后，盡管不會造成與FMDV相同的重大經濟損失，但所引起的水皰性病變，與口蹄疫、豬水泡病、水泡性口炎、豬水皰疹等造成的病變相似，給臨床鑒別診斷造成了一定的困難。樊曉旭等[17]利用RPA技術，針對SVV 3D基因設計引物和探針，建立了實時熒光RPA方法，在40 ℃、10 min內檢測的最低濃度為28拷貝/μL。該等溫快速擴增方法為豬群出現水皰性疾病的鑒別診斷提供了技術支持，對能及時采取適當防控措施具有重要意義。

3 前景與展望

我國養豬業規模巨大，產值高，但是各種病害不斷出現，嚴重制約著我國畜牧業的健康發展。近些年來，隨著現代免疫學和分子生物學技術的不斷創新，動物病原的檢測方法取得了前所未有的發展，但各種方法或因成本過高難以推廣，或因靈敏度過低無法達到檢測要求，或因耗時耗力不實用。RPA結合了血清學和分子技術的優點，并克服了2種方法的缺點，是一種簡單、快速、性價比高的診斷工具，在動物疾病早期診斷、現地檢測、進出口快速檢疫等方面具有巨大的應用前景和市場。以RPA技術為基礎建立的RPA-ELISA、on-chip RPA等擴增技術可以高通量自動化檢測多種病原體，提高檢測效率。另外，RPA技術在癌癥突變檢測、遺傳病的定期和快速普查、動物食品安全衛生、轉基因成分檢測等領域也具有廣闊的應用前景。雖然目前RPA技術的檢測成本高于PCR等其他核酸擴增技術，但隨著RPA技術的進一步發展、完善以及生產工藝的改良，RPA技術有望成為常規的快速診斷手段，并在分子生物學、醫學、遺傳學等各個研究領域得到更加廣泛的應用。

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