中國廣西潿洲島海域海綿Callyspongia sp.的化學(xué)成分研究

徐寶娟，王世玉，唐生安，王 雪

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津 300070）

海洋是天然產(chǎn)物的寶庫，從海洋中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與陸地植物具有顯著結(jié)構(gòu)差異的新穎獨特并具有良好生物學(xué)活性的化合物。美麗屬海綿（Callyspongiasp.）是尋常海綿綱，簡骨海綿目，蜂海綿科動物，在中國、日本、印度等國海域均有分布[1]。海綿中有大量的具有抗微生物、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等活性的化學(xué)成分[2]。海綿的化學(xué)成分主要有脂類[3-4]、生物堿類[5]、肽類[6]、甾醇類[7]、大環(huán)內(nèi)酯類[8-9]、和萜類[10-12]等。本文對美麗屬海綿進(jìn)行了提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定。用硅膠色譜、制備薄層色譜、凝膠色譜和半制備HPLC等方法對各組分進(jìn)行分離得到單體化合物，采用核磁共振譜(1D、2D NMR)、質(zhì)譜(ESI-MS)等方法，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料 核磁共振儀：Bruker AV 400（TMS內(nèi)標(biāo)）；液質(zhì)聯(lián)用色譜儀：Alliance 2695,Quattro Micro TM ESI（Waters）；半制備高效液相色譜儀：日本分光公司（JASCO），PU-2089(泵)，RI-2031 和UV-2075（檢測器）；制備HPLC色譜柱：YMC-Pack SIL SL12S05-2510WT（10 mm × 250 mm）；氘代試劑（ALDRICH公司）；高速逆流色譜儀（HSCCC）：上海同田TBE1000A；柱色譜和薄層色譜用硅膠均系青島海洋化工廠生產(chǎn)，所用試劑均系分析純。

美麗屬海綿（Callyspongiasp.）采自于我國廣西潿洲島海域，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院唐生安副教授鑒定，標(biāo)本（WZA-12）保存于天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

1.2 提取分離 將Callyspongiasp.甲醇提取物14g，用水和二氯甲烷萃取。將二氯甲烷層提取物用HSCCC 以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶3∶2∶1）為流動相洗脫得到9個組分（0101-0109）。

組分 0105、0106合并通過凝膠滲透色譜（GPC），以甲醇為流動相洗脫得到組分0201-0208。將 0203經(jīng)制備 HPLC 純化，甲醇-水（8∶2）為流動相洗脫得到組分0401-0410。將0402經(jīng)制備HPLC純化，甲醇-水（6∶4）為流動相洗脫得到化合物8（1.0mg）。

將水層提取物凝膠柱Toyopearl HW-40柱分離，以甲醇為流動相洗脫得到8個組分（2101-2108）。將2104經(jīng)硅膠柱分離，以二氯甲烷-甲醇（4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1)為流動相梯度洗脫得到 12 個組分（2201-2212）。將2205經(jīng)制備HPLC純化，甲醇-水（4∶6）為流動相洗脫得到化合物 2（242.8 mg），化合物1（16.3 mg）。將2210經(jīng)制備HPLC純化，甲醇為流動相洗脫得到化合物4（15.6 mg）。將2204經(jīng)制備HPLC純化，甲醇-水（6∶4）為流動相洗脫得到化合物5（90.8 mg）。將2206經(jīng)制備HPLC純化，甲醇-水（4∶6）為流動相洗脫得到 3 個組分（2501-2503）。將 2501經(jīng)制備 HPLC 純化，二氯甲烷-甲醇（2∶1）為流動相洗脫得到化合物3（25.8 mg）。將2105經(jīng)硅膠柱分離，二氯甲烷-甲醇（2∶1）、甲醇為流動相洗脫得到8個組分（2901-2908）。將2902經(jīng)制備HPLC純化，甲醇為流動相洗脫得到化合物6（5.4 mg），化合物 7（6.0 mg）。

2 結(jié)果

從海綿中分離得到8個化合物。

2.1 化合物1 牛磺酸，白色無定形粉末。ESI-MSm/z126.02[M+H]+(分子式 C2H7NO3S）。1H NMR（D2O，400 MHz）δ:3.66 （2H,t，J=6.4 Hz），3.85 （2H，t，J=6.4 Hz）；13C-NMR（D2O，100 MHz）δ:37.3,49.2。

2.2 化合物2 乙酰牛磺酸，白色粉末。ESI-MSm/z166.03[M-H]+（分子式C4H9NO4S）。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:1.76（3H，s，-CH3），2.57（2H，t，J=7.4 Hz,-CH2-SO3-），3.27 （2H，m，N-CH2-C），7.79(1H,s,-NH-）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:22.8（-CH3），35.5（N-CH2-C），50.6（-CH2-SO3-），168.9（C=O）。

2.3 化合物3 N-甲基吡啶-2-羧酸鹽，無色針晶。ESI-MSm/z138.07[M+H]+（分子式C7H7NO2）。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:4.30 （3H，s，N-CH3），7.84（1H，t，J=6.0 Hz，5-H），7.90（1H，d，J=7.6 Hz，3-H），8.41（1H，t，J=7.6 Hz，4-H），8.72（1H，d，J=6.0 Hz，6-H）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:46.0（N-CH3），125.0（C-5），125.5（C-3），144.5（C-6），145.2（C-4），156.2（C-2），161.3（COO-）。

2.4 化合物4 zooanemonin，黃色油狀。ESI-MSm/z155.07[M+H]+(分子式 C7H10N2O2)。1H NMR（D2O，400 MHz）δ:3.65 （2H，s，6-H），3.77 （3H，s，9-H），3.87（3H,s,8-H），7.26（2H，s，5-H），8.60（1H，s，2-H）；13C-NMR（D2O,100 MHz）δ:32.4（C-6），33.5（C-9），36.0（C-8），122.0（C-5），132.1（C-4），136.8（C-2），176.0（COO-）。

2.5 化合物5 N-丁基乙酰胺，無色油狀。ESI-MSm/z116.10[M+H]+（分子式 C6H15NO）。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ:0.70（3H，t，J=7.4 Hz，-CH3），1.09-1.18（2H，m，-CH2），1.24-1.32 （2H，m，-CH2），1.77（3H，s，-CH3），2.99 （2H，q，J=7.0 Hz，-NCH2），6.94（1H，s，-NH）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ:13.4（C-6），19.8（-CH3），22.7（-CH3），31.3（N-CH2-C），39.1（NCH2-），170.5（C=O）。

2.6 化合物6 尿嘧啶，淡黃色固體。ESI-MSm/z113.03[M+H]+（分子式C4H4N2O2）。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:5.40（1H，d，J=7.5 Hz，=CH-），7.37（1H，d，J=7.5Hz，=CH-），10.76（1H，s，-NH），10.88（1H，s，-NH）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:100.1（C-1），142.6（C-6），151.0（C-2），163.9（C-4）。

2.7 化合物7 3-甲基尿嘧啶，白色粉末。ESI-MSm/z127.04[M+H]+（分子式C5H6N2O2）。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:3.39 （3H，s，-CH3），5.41 （1H，d，J=7.6 Hz，=CH-），7.37（1H，d，J=7.5 Hz，=CH-）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:62.8 （-CH3），100.2 （C-1），142.5（C-6），151.7（C-2），164.5（C-4）。

2.8 化合物8 苯甲酸，無色針晶。ESI-MSm/z121.04[M-H]+（分子式C7H6O2）。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ:7.46（2H，t，J=7.5 Hz，3，5-H），7.60（1H，t，J=7.3 Hz，4-H），8.11 （2H，t，J=7.7 Hz，2，6-H），11.12（1H，br.s，-COOH）；13C-NMR （CDCl3，100 MHz）δ:128.5（C-3），129.4（C-1），130.3（C-2），133.9（C-4），172.8（COOH）。

3 討論

本文對美麗屬海綿進(jìn)行化學(xué)成分分離、純化并得到單體化合物。通過核磁共振波譜、質(zhì)譜等方法確定化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，從美麗屬海綿分離得到8個化合物，1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，依次鑒定為牛磺酸（1）[13]，乙酰牛磺酸（2）[14]，N-甲基吡啶-2-羧酸鹽（3）[13]，zooanemonin（4）[15]，N-丁基乙酰胺（5）[16]，尿嘧啶（6）[17]，3-甲基尿嘧啶（7）[18]，苯甲酸（8）[19]。化合物 1-5和 7-8均為首次從該屬海綿中分離得到,當(dāng)前海綿已經(jīng)成為海洋藥物研究的熱點之一，本文豐富了美麗屬海綿化學(xué)成分的研究，為進(jìn)一步研究美麗屬海綿的藥理活性提供基礎(chǔ)。例如：牛磺酸作為人體必需氨基酸，在生物體內(nèi)參與一系列生理過程[20]，如調(diào)節(jié)滲透壓[21]，穩(wěn)定細(xì)胞膜[22]，抗氧化[23]等，本文所得的牛磺酸類物質(zhì)可以進(jìn)一步拓展美麗屬海綿的藥理活性研究，以及有關(guān)該類物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系對于其藥理作用機(jī)制影響的研究。