近紅外熒光(NIRF)染料在腫瘤診斷中的應用

趙 勇，王 浩，師長宏

(第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

光學成像作為非侵入性、實時和高分辨率的腫瘤診斷方式，對腫瘤的早期診斷具有重要的意義。光信號可以提供生物組織的分子信息，與腫瘤解剖結構以及腫瘤代謝和生物化學關系密切。在光學成像中，近紅外熒光(near-infrared fluorescence，NIRF)由于其波長在700～1000 nm范圍內，生物組織對該范圍波長的吸收較低、自發熒光較少，因此可以最大限度地減少背景干擾，增強組織的穿透深度和圖像的靈敏性[1]。為了提高腫瘤的靶向性以及近紅外熒光對腫瘤和背景信號的比值(T/B值)，研究者們通過對常規NIRF染料的結構修飾、偶聯腫瘤的靶向配體、納米修飾以及采用多模態成像方式等策略，研發了一批具有腫瘤診斷優勢的NIRF探針。本文主要就NIRF染料在腫瘤診斷研究方面的進展進行綜述。

1 NIRF染料直接應用于腫瘤成像

NIRF探針包括了無機和有機分子。無機NIR染料主要與光量子點[2-3]和納米粒子的修飾相關[4]。但這些納米顆粒的重金屬成分(如鎘、硒)或其表面涂覆材料(例如十六烷基三甲基溴化胺，CTAB)存在潛在細胞毒性[5]，使其無法進行大規模開發和應用[6]。與無機探針相比，有機NIR熒光染料在腫瘤成像中具有極大的應用潛能，人們通過改進NIRF探針的光物理性質，可進行大量化學合成[7]。這些有機NIRF染料還表現出與各種特異性分子結合的能力，如化學小分子、氨基酸、蛋白質、核苷酸、DNA引物、雙鏈DNA和抗體等[8]。它們通過共價或非共價的方式與腫瘤靶向組織進行結合，提高腫瘤檢測的特異性和敏感性。

有機NIRF染料雖然得到廣泛而持續的關注，但大部分NIRF染料依然表現出親水性差、光穩定性差、量子產率低、穩定性不好、在生物體系中檢測靈敏度較低等問題，極大地限制了使用。目前較為成熟的NIRF染料包括花菁類染料、方酸菁、酞菁、卟啉衍生物和BODIPY(硼二吡咯甲烷)類似物等，具有一定的化學和光穩定性、較高的熒光強度和較長熒光壽命。一些染料的水溶性也得到了改善，避免在機體和組織中的聚集。其中，花菁素類和卟啉衍生物的應用最為普遍。

花菁素類染料是通過聚甲基橋連接的兩個芳香族含氮雜環的一類共軛有機小分子體系，通過增加1, 2-亞乙烯基單元延長共振聚甲川鏈可以使吸收波長發生紅移，研究表明每增加一個1, 2-亞乙烯基單元可使吸收光紅移100 nm[9]。花菁素類染料能主動蓄積在腫瘤組織，發揮腫瘤靶向作用，具有較高的T/B值。該類化合物還具有較好的光學性質，如IR-780[10]、IR-783[11]、IR-808[12]和MHI-148[13]等。IR-780具有較高的T/B值，但其強疏水性影響了溶解度[14]；IR-783作為IR-780的衍生物[15]，可以選擇性地在腫瘤部位蓄積，可用于原位或轉移瘤的檢測；類似還有IR-808也可在腫瘤組織主動蓄積，水溶性更好，毒性也較低[16]。另外一類常見的NIRF染料為卟啉衍生物，如四氮雜卟啉247(Pz-247)的熒光發射波長超過700 nm，可與低密度脂蛋白的疏水核心結合，通過受體介導的胞吞，特異性地進入腫瘤細胞[17]。但對于臨床應用來說，腫瘤靶向NIRF染料的整體表現尚不理想，例如溶解性差，存在系統性毒性等問題亟待解決。此外，一些具有疏水性的NIRF染料會蓄積到機體的正常器官，如肺和睪丸。因此，研發水溶性好、毒性低和腫瘤特異性好的NIRF染料將是腫瘤非侵入性診斷的方向。

2 偶聯腫瘤靶向配體的NIRF染料用于腫瘤成像

顯像試劑的腫瘤靶向性對于腫瘤檢測的特異性和敏感性至關重要。然而，大部分的NIRF探針并不具備或僅有極低的靶向能力，這就限制了NIRF染料在腫瘤顯像中的應用。通常NIRF染料需要與腫瘤特異性配體的結合實現對腫瘤的主動靶向性。這些特異性配體包括化學分子、肽、蛋白質，抗體，核酸適配體等，能夠特異性地識別腫瘤細胞相關的生物標記物。

目前，用于體內NIRF腫瘤成像最常見的NIR染料包括cy5、cy5.5、cy7。這些染料和腫瘤特異性的配體進行偶聯識別腫瘤細胞，進行特異性成像，增加成像T/B值。結合的配體包括代謝底物[18]、細胞表面肽[19]、生長因子[20]、抗體[21]和腫瘤細胞表面特異性生物標志物[22]等。例如cy7與前列腺癌特異性分子標志物——前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)分子靶點結合形成cy7-CTT54.2偶聯物[23]；cy7、cy5.5分別與卵巢癌、胃癌αvβ3整合蛋白的cRGD(Arg-Gly-Asp)肽段結合[24]；cy5.5與肺癌新生血管的內皮抑制因子結合等。然而，這種通過NIRF染料與腫瘤靶向配體偶聯的策略依然存在一定的問題，主要體現在這種化學共軛的過程可能會破壞一些NIR染料或腫瘤靶向配體的結構，導致成像或靶向性的損耗或喪失。此外，一些化合物還可能顯示出差的光學穩定性或其它一些缺陷，限制了腫瘤成像的廣泛應用。因此如何保持染料和腫瘤靶向配體結構的穩定以及靶向配體的親和力也是未來研究的重點。

3 納米修飾NIRF探針用于腫瘤成像

隨著納米材料的發展，為增強腫瘤分子成像的靈敏性和特異性提供了新的途徑。基于納米材料的NIRF分子探針可以通過增強腫瘤微血管系統的通透和滯留作用，或通過與腫瘤相關配體的特異性結合靶向到腫瘤，這些配體包括腫瘤細胞受體、腫瘤細胞外基質或酶等。隨著納米技術的快速發展，基于納米材料包裹的NIRF染料越來越多，它們克服了游離染料的局限性，有機NIRF染料的納米包裝可以使得它們產生比未包裝的初級狀態具有更強的熒光信號和更好的光穩定性。一些NIRF染料還通過對納米材料表面的改構，改善NIRF染料的親水性以減少聚集。此外，納米顆粒提供了較大的表面積以延長NIRF染料多次成像的體內循環時間。目前，大量研究集中于納米粒子傳遞以及成像和治療性藥物的整合，已經開發了如二氧化硅、脂質體、低密度脂蛋白或聚合物體(例如殼聚糖聚合物、聚乙烯亞胺和磷酸鈣等)制備的各種NIRF染料包封的納米顆粒[25]，并進行了腫瘤的成像或治療。例如利用二氧化硅顆粒包裹的NIRF染料成功應用于小鼠前哨淋巴結的標記和腫瘤的標記[26]；而超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)納米顆粒包裹吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)和RGD也表現出良好的雙模態腫瘤特異性成像[27]；將ICG包載入30～120 nm的納米顆粒中，可以延緩代謝時間，提高攝取量[28-29]。靶向或非靶向的納米載體均可使包裹的ICG隨納米顆粒一同被腫瘤細胞所攝取并滯留在瘤體內。文獻報道NIRF染料可被納米顆粒或聚合物包裹修飾，通過特異性受體介導的靶向藥物遞送途徑或增強腫瘤微血管系統的滲透性增強與滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR)等途徑實現對腫瘤的主動靶向性[30]。

雖然這些納米顆粒是用于腫瘤特異性成像的較好方式，但它們仍處于臨床應用的早期階段。總的來看，納米顆粒修飾的NIRF染料無毒性、具有良好的生物相容性；同時，利用腫瘤微環境的滲透性增強與滯留效應，使得納米粒等膠粒給藥系統被動靶向富集于腫瘤，實現對腫瘤的被動靶向[5]。但是，目前納米NIRF染料的應用僅限于細胞水平和實驗動物，其潛在的系統性毒性，以及凍干后的穩定性限制了其廣泛應用[31]。因此，開發具有可生物降解或表面包裹的納米顆粒材料，如磷酸鈣、低密度脂蛋白和聚合物等納米粒子的NIRF納米探針將成為未來研究的方向。

4 NIRF染料在術中導航中的應用

外科手術是腫瘤重要治療方法，但在手術過程中，如何動態監測前哨淋巴結、判定腫瘤浸潤和轉移的范圍以及腫瘤切緣是否安全等都是外科醫生面臨的挑戰。NIRF染料的應用研究為解決上述問題提供了有效的方法和手段。NIRF由于其獨特的光學性質，使外科手術更快捷、精準、安全，避免過多切除腫瘤周圍正常組織，提高切除的精準度，降低復發概率，減少并發癥。2009年Ishizawa等最先將ICG應用于肝臟外科的術中導航并取得較好的效果[32]。隨后在腎臟腫瘤、乳腺癌前哨淋巴結、惡性黑色素瘤以及胃腸腫瘤等檢測中都有一定的應用[33]。在肝臟外科中，ICG不僅可以對肝功能進行評價，還能指導肝腫瘤切除[34]以及肝臟移植供體切除[35]等方案的制定。隨著ICG在肝臟外科的應用拓展，還能使膽道[32]和肝細胞癌[36-37]組織可視化。術前注射ICG，在術中通過近紅外光源激發可使得腫瘤在肝臟表面相應透射區呈現熒光。一般情況下不同分化程度的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)存在一定的差異[36-37]，表現在高分化的HCC呈現均勻而高強度的熒光，中等分化的HCC呈現部分而不均勻的熒光顯像，而低分化的HCC以及結直腸肝轉移病灶則不顯示熒光，而是在腫瘤周圍的肝組織呈現環狀熒光顯像。術中腫瘤的熒光成像能提高微小腫瘤的確診率，尤其是臨床檢查和術前影像不能確定時，術中熒光成像表現出絕對的優勢。如果再結合肝臟視診、觸診及術中超聲檢測進行比較和聯合應用，能準確判定腫瘤的大小和位置。此外，熒光顯像技術能夠對切除標本微小轉移病灶進行多層面檢測，防止術中陽性切緣的出現。

5 基于NIRF染料的多模態成像

理想的分子影像技術應該盡可能同時提供生物過程的解剖結構水平、功能代謝水平、生理病理水平和分子細胞水平等信息，但目前尚無一種成像技術能夠同時具備上述功能。鑒于CT、PET-CT、MRI等在腫瘤診斷中的靈敏性，再結合近紅外光學成像的特性，可對NIRF染料分子成像的缺陷進行有效補充[38]。因此，開發基于NIRF的多模態融合分子影像技術具有重要意義。由于NIRF用于生物成像的空間分辨率較低，但MRI和PET能提供較高的分辨率，NIRF與MRI或PET可以彌補這種缺陷。此外，利用MRI對軟組織具有高對比度和空間分辨率優勢，以及NIRF在術中導航的靈敏度和實時性的優勢，開發的MRI-NIRF雙模態分子探針能結合兩種成像技術的優點，對肝癌顯示出較好的成像效果，同時滿足了術前規劃和術中導航的需求[27]，這種策略使得外科醫生在術前能更好地了解腫瘤的數量、位置和大小，并使用NIRF術中導航技術的特性，精準地對腫瘤進行切除。Sampath等利用PET/近紅外試劑用于對晚期乳腺癌的轉移進行分析，并利用術中導航特性對腫瘤進行精準切除[39]；南方醫科大學的研究團隊研發的SPIO@Liposome-ICG-RGD多功能納米探針，就是利用RGD與αvβ3受體的結合能力以及超順磁性氧化鐵的低毒性、高靈敏性以及很好的組織相容性特點，在注射72 h后，通過MRI和NIRF獲得良好的成像效果，給術前診斷和術中導航帶來了極大的便利[27]。

6 NIRF染料的應用前景

多模態成像策略為NIRF染料的應用提供了良好的前景，可能實現對腫瘤組織的早期、準確、全面診斷。結合多模態NIRF成像技術，不僅可以通過術中導航對腫瘤有效切除，而且可對抗腫瘤藥物和放療的治療效果進行評價。但是，現有NIRF染料的光量子產能、熒光基團的強度、組織的穿透性能、熒光的穩定性以及染料與目標靶點的親和力等有待進一步改善和提升。針對上述問題，研究者通過引入強親水性的磺酸基團等方式改善NIRF染料的水溶性[26]。除此之外，凈電荷為零的兩性粒子的應用，也能改善NIRF染料的特性，如凈電荷粒子不與血清結合，具有超低的非特異性組織背景，并且能快速地從體內代謝。

在提高NIRF染料腫瘤靶向性方面，開展腫瘤細胞與正常細胞之間的關鍵病理生理學差異將有助于提高染料對腫瘤的選擇性[40]；另外，一些NIRF染料如花菁染料和卟啉衍生物，已經成為癌癥光動力治療的潛在光敏劑[41]；還有一些具有腫瘤靶向性的多模態NIRF染料可通過進一步的共軛修飾作為腫瘤治療藥物的載體[31]。總之，NIRF在腫瘤的早期診斷中顯示出良好的應用潛能。

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