親和吸附材料特異性清除外源性內毒素有效性的研究

向勇平，崔 輝，劉理金，張金紅，劉 丹，于 杰，周立冬，楊建明，劉愛兵*

(1.錦州醫科大學武警總醫院研究培養基地，北京 100039； 2.武警總醫院醫學實驗中心，北京 100039；3.災害救援醫學北京市重點實驗室，北京 100039； 4.天津市陽權醫療器械有限公司，天津 300350；5.天津市港口醫院，天津 300350)

內毒素血癥(endotoxemia，ETM)是由于細菌釋放大量的內毒素進入機體循環系統，或輸入含有大量內毒素感染的液體，從而引發的一種病理表現[1]。內毒素血癥可致全身炎癥反應綜合癥(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、彌漫性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)等嚴重病癥。研究表明，血液中內毒素濃度的增高與休克事件的發生有關，進入血液的內毒素濃度越高休克發生可能性越大[2]。機體有細菌存在或有高度可疑感染灶所釋放內毒素可致的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，病死率約為30%～60%[3]。血液灌流(hemoperfusion，HP)技術可以通過吸附作用清除血液中的內毒素、凈化血液，以達到治療相應疾病的效果。Shoji[4]對多例MODS患者多次進行灌流治療后，患者內毒素水平從治療前的76 ng/L降至21 ng/L。先前有研究顯示，不同的灌流材料對內毒素的清除作用不同[5]。本實驗采用本課題組研發的高分子親和吸附材料，制備一次性血液灌流器，特異性清除實驗犬體內高內毒素，用以驗證該親和吸附材料對清除高內毒素血癥的有效性和特異性，為臨床上治療內毒素血癥提供新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級比格犬(性別不限)15只，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，無孕，1～2歲，體重(39±1.8) kg [SCXK (軍) 2012-0002]。在軍事醫學科學院實驗動物中心[SYXK (軍) 2012-004]飼養1周后進行實驗，實驗前12 h禁食不禁水，實驗過程中按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

內毒素(Sigma)；內毒素檢測鱟試劑盒(廈門鱟試劑實驗廠有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 ELISA試劑盒(上海酶聯)。心電監護儀(深圳邁瑞ipM12)；大型動物麻醉機(北京眾實迪創ZS-M)；ELX808酶標儀(廈門鱟試劑生物科技有限公司)；DTX880酶標儀(美國貝克曼)。

親和吸附材料及灌流器：本課題組由天津市陽權醫療器械有限公司研發低密度聚合物特異親和高分子吸附材料，制成一次性使用血液灌流器(DHC-II-340型)，該灌流器供本課題犬血液灌流使用。

1.3 實驗方法

1.3.1 內毒素動物模型的建立

犬禁食12 h，在麻醉前15 min給予0.25 mL阿托品肌肉注射，并使用氯胺酮4 mg/kg加胃復安10 mg肌肉注射進行誘導麻醉，待犬昏迷后取仰臥位固定四肢，麻醉機維持麻醉。在左頸靜脈處靜脈留置針穿刺以備抽取血液標本。鈍性分離左側股靜脈，進行靜脈插管，內毒素0.45 mg/kg溶于生理鹽水100 mL，經靜脈在30 min內完成輸注。

1.3.2 灌流通路的肝素化

啟動血泵，用生理鹽水300 mL+肝素10 mg，以100 mL/min的速度沖洗灌流器，排除管道內的空氣，進行灌流通路的肝素化，最后用生理鹽水250 mL+肝素50 mg在灌流通路中閉式循環10 min后備用。

1.3.3 血液灌流

鈍性分離犬右側股動脈，連接灌流導管、血泵和灌流器，形成閉合體外循環通路。由血泵提供動力，血液經過灌流器后返回體內。造模后45 min治療組用本課題組研發的灌流器灌流，對照組不用該灌流器。灌流開始后用肝素泵持續并追加肝素12 mg/h，在灌流結束前30 min停止使用肝素。灌流120 min后，采用空氣回血法讓血液流回犬體內，縫合傷口。

1.3.4 測定指標

(1)內毒素檢測：分別于灌流開始前、灌流120 min時抽取靜脈血2 mL，經離心后取血清，用動態濁度法測定犬血液中內毒素水平。內毒素清除率計算方法：R(%)=(C0- Ct)/C0× 100%，C0、Ct分別為內毒素的初始濃度及t時間吸附后的濃度。

(2)細胞因子測定：用ELISA法測定灌流開始(造模后45 min)、灌流120 min血清中的細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的水平。

(3)生命體征監測：實驗過程中監測犬的生命體征，包括體溫(body temperature)、脈率(pulse rate，PR)、呼吸頻率(respiratory rate，RR)、收縮壓(systolic arterial pressure，SAP)，記錄灌流開始(造模后45 min)、灌流60 min、灌流120 min實驗動物的生命體征。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 內毒素清除效果

造模成功后，治療組在灌流開始前、灌流120 min后血液內毒素水平分別為(118.63±27.98)、(0.039±0.009) EU/mL，對照組在灌流開始前、灌流120 min后血液內毒素水平分別為(117.16±22.95)、(131.98±7.01) EU/mL。治療組灌流開始與灌流120 min比較，差異有顯著性(P< 0.05)，內毒素平均清除率R=94.07%；對照組灌流開始、灌流120 min比較，差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2 對細胞因子的清除效果

治療組、對照組灌流開始、120 min時血清中細胞因子測定結果見表1。

從表1中看出治療組灌流120 min后血清中各細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的水平都有顯著下降，與灌流開始時比較差異有顯著性(P< 0.05)；對照組中各指標灌流120 min后都有所上升，且與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 對生命體征的影響

兩組灌流中，分別記錄灌流開始、灌流60 min、灌流120 min三個時間點的生命體征，數據見表2。

Tab.1Clearance effect of cytokines before and after perfusion

治療組(n=10)Treatmentgroup對照組(n=5)Controlgroup灌流開始Beginningofperfusion灌流120minAfterperfusionfor120min灌流開始Beginningofperfusion灌流120minAfterperfusionfor120minTNF?α153±027013±006?153±006226±015?IL?1β1282±166070±036?1305±0181512±018?IL?65477±398162±080?5458±0196254±093?IL?8025±032001±000?028±006073±093?

注：與灌流開始相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the beginning of perfusion,*P< 0.05.

Tab.2Changes of vital signs during perfusion

治療組(n=10)Treatmentgroup對照組(n=5)Controlgroup灌流開始Beginningofperfusion灌流60minAfterperfusionfor60min灌流120minAfterperfusionfor120min灌流開始Beginningofperfusion灌流60minAfterperfusionfor60min灌流120minAfterperfusionfor120min體溫(℃)Bodytemperature385±0．94375±0．84?369±0．63?387±019388±009?392±026?呼吸頻率(每分鐘次數)Respiratoryrate(timesperminute)290±1．13250±1．38?270±0．69?300±110320±148350±130?脈率(每分鐘次數)Pulserate(timesperminute)850±4．10800±4．58840±3．34870±297890±179?920±158?收縮壓(mmHg)Systolicarterialpressure1630±11．251580±11．511600±11．551630±3051630±1921640±130

注：單因素方差分析，*P< 0.05。

Note. Single factor analysis of variance,*P< 0.05.

從表2看出，治療組灌流開始時實驗犬體溫最高，隨著灌流治療的延續體溫逐漸下降，灌流60 min、120 min與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)；灌流60 min、120 min的呼吸頻率與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)。對照組體溫、脈率隨著灌流的進行逐漸上升，灌流60 min、120 min分別與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)；呼吸頻率隨灌流的進行逐漸上升，灌流開始與灌流120 min比較差異有顯著性(P< 0.05)。兩組在灌流中收縮壓都保持平穩。

3 討論

隨著材料技術和免疫學的快速發展，吸附材料的發展也日新月異，在醫學上的應用也展現出不錯的前景。目前，由于膜吸附材料具有脂溶性，對清除高分子溶質、脂溶性好或蛋白結合的毒物作用有限；聚乙烯基咪唑對人體產生不良反應；多粘菌素B容易從載體上脫落加重腎的負擔。本課題組選擇親水單烯和疏水芳香雙烯單體制得“雙親性”大孔共聚物，再引入間隔臂將此共聚物與含大量氨基酸的配基相連制成“雙親型”親和吸附材料，這種吸附材料無毒、無味、可降解且具有良好的血液相容性，也能夠高效地清除血液中的內毒素及內毒素作用下機體產生的炎癥介質，并且能夠在使用中具有良好的穩定性。

本課題組研發的親和吸附材料所制成的一次性灌流器，在犬內源性內毒素血癥的研究中已取得極好的效果[6]。本實驗將其應用于犬的外源性內毒素血癥的清除治療中，并探討該材料清除內毒素的有效性。本實驗治療組對內毒素的平均清除率可達94.07%，對清除內毒素作用機體產生的炎癥介質也作用十分顯著。對照組中內毒素及相應細胞因子的水平保持上升。研究證明，當機體受內毒素刺激后，機體的單核巨噬細胞系統和炎性反應細胞被激活，會釋放大量的炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等最終導致瀑布樣炎癥級聯反應[7-8]。目前的研究認為，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子所導致的瀑布樣炎癥級聯反應與體內內毒素的濃度密切相關[9-10]，因此阻斷瀑布樣炎癥級聯反應，是關于高內毒素血癥的靶標治療[11]。本實驗治療組通過血液灌流，清除血液中的內毒素，及時阻止炎癥因子的釋放，從而達到減少內毒素對機體單核巨噬細胞系統和炎性反應細胞的刺激，進一步加大了本實驗清除內毒素的有效性。內毒素可直接作用于下丘腦體溫調節中樞或白細胞，使其釋放內源性致熱原，引起發熱反應[12]。治療組中犬的體溫隨著體內內毒素的清除而下降是因為減少了致熱原的產生而阻斷了發熱反應；在灌流過程中呼吸頻率、收縮壓等生命體征有輕微的波動，但都在正常范圍之中趨于平穩。對照組中犬的體溫、脈率、呼吸頻率都有相應的變化，可能是體內內毒素水平持續升高所導致的，但收縮壓保持平穩，說明內毒素及灌流治療對血壓沒有影響，待進一步的探討。

實驗結果表明，本課題研發的高分子親和吸附材料能高效地清除血液中內毒素及內毒素作用機體產生的炎癥因子，可以及時降低內毒素對機體的危害。

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