孤養對單次延長應激建立的創傷后應激障礙模型大鼠行為學的影響

方錦穎，陳光耀，李龍梅，鄭思思，毛 萌

(北京中醫藥大學，北京 100029)

創傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)指在經歷或目睹重大災難性應激事件后延遲出現并長期存在的一種精神疾病[1]。作為焦慮障礙的一種，其核心癥狀包括：反復出現創傷體驗，持續回避創傷事件，警覺性的高度提高和心理的消極變化[2]。單次延長應激(single-prolonged stress，SPS)作為通過以疲勞為環境條件建立的敏感化動物模型的一種，較好地模擬了PTSD臨床患者應激過程及發病后的癥狀。較之于其他PTSD動物模型，SPS模型重復性良好，且該模型能夠被抗抑郁及抗焦慮藥物所改善，逐漸成為當今研究PTSD最為常用的國際公認動物模型之一[3]。

對SPS模型的嘗試改進以增加該模型的表觀、預測和結構效度與臨床的吻合度為當今研究的熱點。如Keller等人[4]依據臨床PTSD發病率女性高于男性的特點，研究發現SPS雌性大鼠模型較之于雄性模型大鼠行為學條件恐懼行為增加；趙中興、陳旺等人[5-6]采用在大鼠束縛過程中增加不可逃避足底電刺激建立復合應激模型，行為學研究發現復合應激組較之于單純SPS組行為學出現焦慮樣癥狀增加、活動性降低、空間記憶受損等特點。孤養作為一種應激手段，被應用于新生期孤養、慢性不可預見應激等大鼠模型的建立[7-8]。本文擬通過將SPS模型與SPS聯合孤養模型進行對比，探究孤養對單次延長應激(SPS)建立的創傷后應激障礙(PTSD)模型大鼠的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠36只，體重190～210 g，6周齡，實驗動物購自北京維通利華實驗動物科技有限公司[SCXK (京) 2016-0011]，在北京中醫藥大學SPF級實驗動物室[SYXK (京) 2016-0038]飼養，飼養條件：溫度(23±2)℃，濕度(65±5)%，光照12 h，每天更換墊料、飼料及水瓶，自由飲水及進食，造模前一周購入進行適應性飼養。

1.2 主要試劑與儀器

75%乙醇，安徽太和縣光明酒精分裝廠，批號：160606；無水乙醚，北京化工廠，批號：20170417。圓桶狀透明塑料大鼠固定器：長25 cm，筒口外徑7 cm，內徑5 cm，由北京中醫藥大學方劑學教研室提供；曠場箱：底部100 cm×100 cm正方形、高45 cm，材料為灰色木質，箱底部用黑線劃分出25個正方形格(20 cm×20 cm)，攝像頭位于曠場箱正中格上方；造模及強迫游泳使用水箱：底部65 cm×100 cm、高80 cm的立方形紅色塑料水箱；行為學觀察及自動分析系統：Nodule公司生產，包括計算機、攝像監控系統、Observior及Ethevision行為學分析軟件。曠場箱、水箱和行為學觀察及自動分析系統由北京中醫藥大學診斷系神經免疫實驗室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及造模

將大鼠適應性喂養后，隨機分為3組，即正常組、SPS模型組、SPS聯合孤養組，每組各12只，經檢測各組大鼠體重在同一基線水平上。正常組不予處理，SPS模型組與SPS聯合孤養組進行SPS造模，流程如下：使用束縛桶將大鼠進行2 h束縛，隨后置于水深45 cm、水溫25℃的水箱中進行20 min的游泳，游泳結束15 min后將大鼠置于密閉玻璃容器中使用乙醚進行麻醉，失去意識后置于籠子中放置在通風處，待意識恢復后進行靜養[9]。造模后正常組、SPS模型組每籠6只進行飼養，孤養組每籠1只，大鼠均放置于普通飼養籠中進行飼養。除更換墊料、飼料及飲水外，避免打擾大鼠，連續飼養7 d后進行行為學檢測。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.3.2 實驗指標檢測

(1)大鼠體重增長數：在造模前及行為學實驗結束后分別使用電子秤測量大鼠體重，后一次體重減去前一次體重即為大鼠體重增長數。

(2)曠場實驗[10-11]：實驗者穿著純黑色衣服(避免軟件分析時實驗者身體某些淺色部位被識別為大鼠)將動物放入箱內的正中格，迅速將進入曠場區域的手撤出，開始進行錄像5 min，錄像過程中實驗人員應遠離曠場箱以避免對動物造成干擾。每只動物測試結束后用蘸有酒精的毛巾擦拭曠場箱內部，以避免對下只動物的測試造成影響。錄像結束后采用軟件對錄像進行分析，測得每組大鼠5 min內運動總距離、穿格次數以及單次最大運動距離。

(3)僵立行為測試[12]

使用造模時水箱，將水注入箱中(調節使水深45 cm、水溫25℃)，將大鼠小心放置于水箱中。僵立時間的記錄標準為大鼠在水中靜止不動，但可以有輕度搖擺，除保持呼吸運動外其他的肌肉活動均消失。記錄5 min內大鼠僵立時間及次數。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠體重增長數

SPS模型組大鼠體重增長數(28.3±4.9)g較正常組(34.8±4.8)g降低，差異有顯著性(P< 0.01)，SPS聯合孤養組(30.0±4.8)g較之于正常組大鼠體重增長數降低，差異有顯著性(P< 0.05)，SPS聯合孤養組較之于SPS模型組差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2 大鼠曠場實驗運動總距離、穿格次數、單次最大運動距離

SPS模型組較正常組運動總距離、穿格次數減少，差異有顯著性(P< 0.05)，單次最大運動距離減少，差異有顯著性(P< 0.01)；SPS聯合孤養組較之于正常組運動總距離、穿格次數、單次最大運動距離差異無顯著性(P> 0.05)；SPS聯合孤養組較之于SPS模型組運動總距離、穿格次數、單次最大運動距離增加，差異有顯著性(P< 0.05)。見表1。

2.3 大鼠僵立行為次數及時間

SPS模型組較正常組僵立行為次數、僵立時間增加，差異有顯著性(P< 0.01)；SPS聯合孤養組較之于正常組僵立行為次數、僵立時間增加，差異有顯著性(P< 0.05)；SPS聯合孤養組較之于SPS模型組僵立行為次數、僵立時間差異無顯著性(P> 0.05)。見表2。

3 討論

應激能夠造成實驗動物內分泌系統及消化系統功能紊亂，從而出現體重增長速度較前減少[13]。曠場實驗通過觀察實驗動物在新異環境中的自主行為、探究行為與緊張度，從而反映出大鼠的焦慮水平[14]。僵立行為測試將大鼠重新置于造模時場景，當大鼠重新受到負性刺激后表現出的恐懼反應，是檢測SPS模型是否成功復制的重要指標。造模7 d后SPS模型組較之于正常組，大鼠體重增長數減少，曠場實驗運動總距離、穿格次數、單次最大運動距離均減少，僵立行為測試僵立次數及時間增加，與之前文獻記載相符，提示對SPS模型進行了成功復制[15]。

在精神類疾病動物模型的制作中，孤養作為一種負性情緒刺激被作為應激源廣泛應用。在本次實驗設計中，預期將孤養作為一種額外應激刺激附加于SPS模型，從而使SPS模型更加穩定以及PTSD相關表現更加明顯。但本實驗結果發現，SPS聯合孤養組造模7 d后較之于SPS模型組曠場實驗運動總距離、穿格次數、單次最大運動距離增加，提示SPS聯合孤養組較之于SPS模型組焦慮水平降低。結果表明7 d孤養使得SPS模型焦慮狀態得到改善，與預期結論截然相反。

Tab.1Total movement distance, frequency of grid crossing and single maximum movement distance of the rats in each group during the open field test

組別Groups運動總距離(cm)Totalmovementdistance穿格次數Frequencyofgridcrossing單次最大運動距離(cm)Singlemaximummovementdistance正常組Normalgroup22029±5349862±290113±36SPS模型組SPSmodelgroup15099±7514a547±368a73±24bSPS聯合孤養組SPScombinedwithsocialisolationgroup24066±7475cd958±342cd105±29cd

注：與正常組比較，aP< 0.05，bP< 0.01，cP> 0.05；與SPS模型組比較，dP< 0.05。

Note. Compared with the normal group,aP< 0.05,bP< 0.01,cP> 0.05. Compared with the SPS model group,dP< 0.05.

Tab.2Freezing frequency and time of the rats in each group

組別Groups僵立次數Freezingtimes僵立時間(s)Freezingtimeduration正常組Normalgroup083±111075±101SPS模型組SPSmodelgroup775±742a652±530aSPS聯合孤養組SPScombinedwithsocialisolategroup442±438bc351±369bc

注：與正常組比較，aP< 0.01，bP< 0.05；與SPS模型組比較，cP> 0.05。

Note. Compared with the normal group,aP< 0.01,bP< 0.05. Compared with the SPS model group,cP> 0.05.

創傷后應激障礙(PTSD)患者在遭受巨大應激過后，當再次出現與應激相關聯或類似的事件、情景或其他線索時，常表現出強烈的心理與生理反應。為避免這種反應的出現，患者往往出現持續回避的系列癥狀，包括與他人避免接觸及獨自生活于安靜的環境中，提示回避可能是PTSD患者的一種自我保護性反應，將大鼠單獨進行飼養從一定程度上滿足了PTSD大鼠進行回避的需求[16]。在實驗過程中亦發現在經歷巨大應激過后，大鼠常處于易激惹狀態，在群居過程中更容易出現打斗，因此群居飼養可能會對大鼠造成額外的應激。在動物模型的制作中，將孤養作為應激源進行造模多采用較長時間的干預，本研究僅僅對SPS造模后孤養7 d的大鼠進行觀察，造模7 d后SPS聯合孤養組焦慮水平較之于SPS模型組降低，提示在SPS造模后進行7 d孤養可能作為一種保護機制作用于模型大鼠，而進一步延長孤養時間是否會對SPS模型造成負性機制尚不得而知。因此，課題組進一步將對SPS聯合孤養模型多個時間點的行為學改變進行觀察，以明確孤養對SPS模型影響的具體時間點，并進一步探究其相關病理及分子機制。

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