慢性胃腸黏膜損傷樹鼩模型建立的探索

葉尤松，高家紅，趙 汝，李哲麗，王陳蕓，馬開利*，唐東紅*

(1.中國醫學科學院，北京協和醫學院醫學生物學研究所，昆明 650118； 2.云南農業大學動物醫學院，昆明 650201)

胃腸黏膜損傷導致的胃腸疾病是一種臨床上常見的急、慢性消化系統疾病，常反復發作，給患者的身心健康帶來極大的危害，建立理想的胃腸黏膜損傷性消化道動物模型，對探索該病的病因、發病機制、病變發展規律，明確治療方法及研發新藥均有積極意義。目前報道的胃腸黏膜損傷動物模型造模方法主要有：應激性造模、藥物造模、乙酸或乙醇致胃潰瘍模型等。早期有研究者采用能選擇性破壞中腦黑質多巴胺能神經元的毒性物質1-甲基-4-苯基-l, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP)，腹腔注射大鼠后導致其胃、十二指腸黏膜損傷和潰瘍[1-2]。用于胃腸潰瘍動物模型研究的實驗動物，主要有大、小鼠等嚙齒類動物，由于嚙齒類與人類神經系統差別較大，建立一種費用相對低廉，能更好模擬人類神經精神因素影響所致胃腸黏膜損傷的發生、愈合及復發的動物模型，為研究胃腸病神經機制提供更理想的動物模型很有意義。樹鼩(Tupaiabelangeri，tree shrew)的遺傳學研究表明其在生物學上比嚙齒類動物更接近靈長類動物，有著明顯大于大鼠的大腦和更高級的神經系統，應用樹鼩進行神經系統疾病研究有良好的前景[3]。與靈長類動物相比，樹鼩又具有體型小、繁殖能力強的特點，在實驗操作上也更為簡便，但目前尚無利用樹鼩成功制作胃腸疾病模型的報道。因此，本實驗選擇長期低劑量腹腔注射MPTP的方法，嘗試用樹鼩制作胃腸黏膜損傷模型，探索其可行性，為探索樹鼩神經精神因素導致的消化系統疾病模型的開發和利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12只滇西亞種普通級雄性樹鼩，體重(153±6) g，12～18月齡，實驗所用樹鼩均由昆明醫科大大學提供 [SCXK (滇) K2013-0002]，實驗在中國醫學科學院生物醫學研究所完成 [SYXK (滇) K2014-0007]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

甲醛、苦味酸和冰醋酸(重慶川東化工有限公司化學試劑廠)；Bouin液由苦味酸飽和液75 mL、福爾馬林25 mL和冰醋酸5 mL配制而成；戊巴比妥鈉，用時配制成1%的水溶液，每只樹鼩按100 g體重0.2 mL劑量進行腹腔注射；MPTP(購自美國Sigma公司)，用時用生理鹽水配制成濃度為1 mg/mL的溶液；三氯乙酸(購自上海滬震實業有限公司)。Nikon SMZ1500尼康高級體視顯微鏡，日本Hitachi Himac CT15RE高速離心機，美國安捷倫高效液相色譜儀Agilent 1100，日本島津AY220電子分析天平，德國徠卡病理系統(Leica Biosystems)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型誘導

選取成年健康雄性樹鼩12只，隨機分為3組，每組4只，分別為2 mg/kg劑量組、1 mg/kg劑量組和對照組。早餐后，2 mg/kg劑量組腹腔注射MPTP 2 mg/(kg·d)，1 mg/kg劑量組腹腔注射MPTP 1 mg/(kg·d)，對照組腹腔注射等體積生理鹽水，連續56 d。

1.3.2 一般情況觀察

實驗過程中每天觀察各組動物精神狀況、活動、飲食、糞便、毛色以及體重等情況并做相應記錄，每周稱量體重一次。

1.3.3 測定指標

56 d后，采用1%戊巴比妥鈉溶液按每100 g體重0.2 mL劑量對樹鼩腹腔注射麻醉，待樹鼩麻醉后采集腦脊液，用高效液相色譜儀測量腦脊液中多巴胺(dopamine)含量。

1.3.4 病理學檢查

腦脊液采集完成后，脫臼處死樹鼩，剖腹，從幽門和賁門部截取整個胃，從幽門后1 cm處截取十二指腸，用雙面刀片沿胃大彎剖開胃，縱向剖開十二指腸，用注射器吸取Bouin液沖洗胃和十二指腸內壁，擦去內容物，用體視顯微鏡觀察胃前壁內側面、胃竇與腸內壁，并拍照做記錄，之后分別取胃體、胃竇、十二指腸三部分繼續置于Bouin液中固定，常規石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察胃腸組織形態學變化。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況的觀察結果

2 mg/kg劑量組腹腔注射MPTP [2 mg/(kg·d)]后，其中有2只樹鼩先后出現了一過性、暫時性的急性帕金森綜合征癥狀(如：行動緩慢，反映遲鈍，四肢無力，步態不穩，不能站立)，2只樹鼩之間表現強弱略有細微差異，均在每天給藥后持續約5 min左右，之后恢復正常。但上述帕金森癥狀是只有在腹腔注射MPTP之后才會出現的急性癥狀，而且此癥狀持續一周之后就不再出現。其它指標和其它樹鼩相同，即腹腔注射后至第3周末，精神狀態、毛色、排糞尿正常，但食欲下降，活動量減少，第4周開始對照組逐漸恢復正常，模型組依舊活動量少，食欲明顯下降，毛皮蓬松沒有光澤，排糞時好時壞，部分樹鼩糞便呈黑色。

2.2 樹鼩體重變化情況

每周稱量體重一次發現，1 mg/kg劑量組和2 mg/kg劑量組從開始至第8周體重均出現逐漸下降趨勢；對照組從實驗開始到第4周出現體重下降，第4開始逐漸上升直至恢復，如圖1所示。

圖1 樹鼩體重變化情況Fig.1 Changes in body weight of the tree shrews

2.3 樹鼩腦脊液中多巴胺含量檢測結果

多巴胺含量檢測結果顯示(見表1)，模型組樹鼩腦脊液多巴胺含量均比對照組樹鼩的多巴胺含量明顯減少(P< 0.05)；1 mg/kg劑量組和2 mg/kg劑量組比較差異無顯著性(P> 0.05)。提示注射MPTP能選擇性破壞樹鼩中腦黑質多巴胺能神經元，使樹鼩腦脊液中多巴胺含量明顯降低。

Tab.1Dopamine contents in cerebrospinal fluid of the tree shrews

組別Groups多巴胺含量Dopaminecontents對照組Controlgroup33466±33431mg/kg劑量組1mg/kggroup22857±3406Δ2mg/kg劑量組2mg/kggroup25343±5258Δ

注：與對照組比較，ΔP< 0.05。

Note. Compared with the control group,ΔP< 0.05.

2.4 形態學觀察結果

2 mg/kg、1 mg/kg劑量組肉眼均可見樹鼩胃腸外形大小、顏色正常；也可觀察到胃腸道表面布滿淤血，內容物呈黑色。體視鏡下兩組均有不同程度的胃腸黏膜損傷，具體表現為，胃黏膜局部充血或有彌漫性出血點，內壁上多處紅腫出血，覆蓋白色苔狀物(如圖2B)，或胃黏膜部分輕微脫落，多處呈異樣粉紅色，內壁上有零星散在輕微出血點(如圖2C)，胃竇與十二指腸則表現為正常無異樣狀況；也有十二指腸黏膜顏色略微加深，覆蓋白色苔狀物，壁上多處紅腫出血，或有散在出血點(如圖2D)。但兩組在胃腸黏膜損傷程度上沒有明顯區別；對照組肉眼和體視鏡下觀察，4只樹鼩胃、十二指腸均無異常表現，胃內容物少，胃腸黏膜完整清潔，結構完整，大小、形態、顏色均正常。結果見圖2。

注：A：對照組胃內壁；B、C：實驗組胃內壁；D：實驗組十二指腸。圖2 體視鏡下樹鼩胃腸形態學變化(× 40)Note. A: Inner wall of the stomach in the control group. B, C: Inner wall of the stomach in the experimental groups. D: Duodenum in the experimental group.Fig.2 Morphological changes of gastrointestinal tract of the tree shrews observed by stereoscopy

2.5 HE染色結果

2 mg/kg和1 mg/kg劑量組大部分樹鼩鏡下見正常胃壁黏膜；胃體黏膜可見少許淋巴細胞及漿細胞浸潤，部分表層黏膜脫落，少部分樹鼩可見胃黏膜損傷明顯，突出表現為黏膜下細胞水腫，部分胃黏膜結構紊亂，伴隨有出血、脫落的壞死黏膜，或有粘膜上皮脫落，固有層充血，并有炎性細胞浸潤，杯狀細胞增多，粘膜下層充血水腫并有炎性細胞滲出，肌纖維間有大量炎性細胞浸潤(如圖3B)；胃竇部胃小凹粘膜上皮脫離，固有層出血，并有炎性細胞浸潤，胃腺杯狀細胞增多，少許樹鼩腸腺上皮細胞發生化生，粘膜下層充血，有炎性細胞滲出，肌層細胞發生變性壞死(如圖3C)；十二指腸粘膜上皮脫落，固有層充血，粘膜的杯狀細胞增多，部分區域出現了炎細胞的慢性炎癥改變，少許樹鼩有固有層和粘膜下層的結締組織增生，有多量淋巴細胞浸潤(如圖3D)，兩組比較無明顯區別。對照組樹鼩胃腸主細胞、壁細胞形態正常，胃壁漿膜層、肌層、黏膜下層、黏膜層四層結構清晰完整，黏膜層腺體排列整齊。見圖3。

注：A：對照組胃體；B：實驗組胃體；C：實驗組胃竇；D：實驗組十二指腸。圖3 樹鼩胃腸病理變化(HE染色，× 400)Note. A: Gastric body, control group. B: Gastric body, experimental group. C: Gastric antrum, experimental group. D: Duodenum, experimental group.Fig.3 Pathological changes of gastrointestinal mucosa of the tree shrews. HE staining

3 討論

胃腸道疾病是常見、多發病，常見黏膜損傷為其主要病變，心理因素及不良生活習慣均可誘發。隨著生活節奏加快，不良生活習慣，以及社會、工作、家庭、心理負擔加重，該病的發病率有逐年上升趨勢[4-5]。建立一種理想而穩定的動物模型，模擬人類神經精神因素引起的胃腸疾病患者的病理病程、生理改變等特點，對人類胃腸病的研究很有必要。

MPTP是一種神經毒素，能選擇性破壞中腦黑質多巴胺能神經元致動物體內分泌的多巴胺含量減少。多巴胺是一種源于酪氨酸的重要胃腸神經遞質，參與人的情緒(感情、欲望)等調節，通過與胃腸道多巴胺受體(dopamine receptors，DR)結合參與胃腸道消化性潰瘍的發生。因此，MPTP已經被認為是致實驗動物潰瘍病的毒性物質，大鼠腹腔注射后可導致胃、十二指腸黏膜損傷和潰瘍[2,6-9]。本實驗動物模型的建立，除了選擇公認的試劑MPTP外，還選取了在生物學上比嚙齒類動物更接近靈長類動物，有著比大、小鼠更高級的神經系統，又具有體型小、繁殖能力強，在實驗操作上更為簡便等特點的新型實驗動物——樹鼩作為模型動物[10-11]；采用小劑量、長期腹腔注射MPTP造模后，對照組和模型組樹鼩給藥后3周均出現活動減少、食欲下降、體重減輕情況，第4周后對照組樹鼩體重、食欲和精神狀況逐漸恢復正常，模型組從開始至第8周體重均呈逐漸下降趨勢。結果表明，注射MPTP后，體內分泌的多巴胺含量變化，導致胃腸生理功能，包括胃腸運動和營養物質的吸收等出現紊亂。

造模后一般觀察結果及樹鼩腦脊液多巴胺檢測結果表明，MPTP能在中樞和周圍神經系統選擇性地作用于多巴胺能神經元，引起這些神經元破壞，多巴胺含量減少，導致迷走神經功能紊亂和出現類似于帕金森病的癥狀，結果和已報道的觀點相一致[12-13]。結果顯示，帕金森癥狀只在高劑量組[2 mg/(kg·d)]動物一過性出現，提示2 mg/kg劑量可能是樹鼩MPTP給藥的臨界點。

本實驗模擬了人用胃鏡形態學觀察原理，體視鏡下觀察樹鼩胃腸形態學變化，并綜合一般觀察、樹鼩腦脊液多巴胺檢測及樹鼩胃腸病理組織學觀察，結果表明：通過小劑量[1～2 mg/(kg·d)]長期腹腔注射(8周)神經毒物質MPTP，致樹鼩胃腸黏膜損傷模型，在很大程度上能模擬人因精神因素而導致的胃腸黏膜損傷慢性發病進程，造模方法可行，理想給藥劑量為2 mg/(kg·d)。由于種屬特異性的原因，樹鼩胃泌素、胃動激素等激素的檢測尚無公認的檢測方法，相關數據的觀察有待進一步研究和探討。

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