輔助生殖技術對小鼠表型影響的研究進展

胡永艷，孔申申

(北京大學第一醫院實驗動物中心，北京 100034)

輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)已廣泛應用于人類不育治療及家畜優良種質資源高效利用。體外受精(invitrofertilization，IVF)是一種關鍵的輔助生殖技術。在實驗動物科學研究中，IVF技術常用于基因修飾小鼠的制作、冷凍保種、生物凈化以及快速擴大繁殖等操作，通過使用IVF技術能夠大大提高基因修飾小鼠的繁殖效率和品系保存質量，保持遺傳背景的穩定性。IVF后代同正常受精后代小鼠在遺傳物質上幾乎無差異，但目前動物實驗相關證據表明，IVF后代同正常受精鼠后代在生長發育、器官組織生理特性、代謝等不同層面存在差異。本文通過分析綜述IVF對性別、生長發育、行為學、壽命、器官和組織代謝以及分子表型等的影響，以期對IVF技術在基因修飾小鼠快速繁殖、凈化、保種等應用中可能出現的問題提供一定的指導意義。

1 性別比研究

IVF小鼠同自然繁育后代小鼠相比，從植入前到產前階段有顯著的性別差異，IVF小鼠雄性增多。在植入前階段，雌性IVF胚胎似乎更容易受到IVF誘導的影響，包括凋亡百分比顯著增加，經典的性別相關基因的表達異常(Xist、Hprt、Pgk1和Hsp70)。在妊娠中期，胚胎第13.5天(E13.5)IVF雄性胎兒的生存率高于IVF雌性胎兒(雄∶雌=1.33∶1)，伴有雌性偏倚的妊娠丟失。妊娠晚期，E19.5 IVF雄性胎鼠性別比高(雄∶雌=1.48∶1)。出生后，IVF雄性鼠的生長速度比其體內胚胎雄性對照鼠高，而IVF雌性與體內胚胎雌性呈現相似的生長模式[1]。

性別比是生殖健康的一個重要指標，其性別失衡反映了胚胎發育的缺陷。IVF引發的表觀修飾錯誤可能是造成性別失衡的主要原因。小鼠IVF后代的性別比例失衡是由于圍植入期雌性胚胎傾向性的發育異常所致。有研究發現雌性IVF附植前胚胎存在Xist表達抑制和印跡X染色體失活(imprinted X-chromosome inactivation，iXCI)異常的表觀修飾錯誤，并發現在胚胎體外培養液中適時添加適量的視黃酸可以校正IVF引發的iXCI不足問題，并有效地校正出生性別比例[2]。

2 生長發育影響

胚胎發育早期的環境應激能夠影響出生后表型，這些生理表型可能出現于成年后。小鼠受精卵在營養不充足的培養基中發育10 h即可改變出生體重和出生后的生長[3]。Le等[4]以小鼠為研究對象，應用常規的IVF技術建立小鼠模型。實驗結果顯示，IVF組出生率明顯低于對照組；IVF組出生體重明顯高于對照組，而在第2周及第3周時，出現了相反的結果，IVF組體重明顯低于對照組，第4周后直到性成熟期(8～10周)兩組之間又表現為差異無顯著性，表明IVF技術對小鼠的早期生長發育具有一定的影響，而隨著生長發育這些影響逐漸減少，應加強對IVF子代早期生長發育的監督及評估。另一項研究同樣發現IVF小鼠出生體重增加[5]，而對胎鼠的體重研究發現[6]，ART小鼠在E18.5導致胎兒重量減少和胎盤過度生長。ART鼠胎盤在E18.5表現出胎盤層分離和糖原細胞遷移缺陷的組織形態學改變，ART操作導致大部分胎盤營養轉運蛋白的下調和胎盤效率的降低。ART胎盤改變與H19、KvDMR1的印跡控制區的甲基化水平升高相關，并且破壞了E18.5對于胎盤發育和功能重要的絕大多數印記基因的表達。小鼠模型的結果顯示了ART操作可以通過破壞胎盤發育和功能來影響胎兒生長的第一個證據，表明由胚胎操作引起的基因組印記的改變可能導致這些問題出現。

體重是生長發育的重要指標，文獻分析發現由于ART操作導致胎盤效率降低，IVF組在E18.5胎鼠重量減少，而IVF小鼠出生體重增加有表觀遺傳調控的參與，自胚胎末期至出生體重結果的變異目前分析可能是由于不同的研究體外培養條件有差異，具體原因有待進一步研究。

IVF是否會影響小鼠壽命方面的研究存在爭議，有研究發現正常飲食的小鼠壽命沒有差異[7]，也有研究發現，與對照組相比，飼喂高脂飲食的ART小鼠的壽命縮短約25%，且表觀遺傳改變導致了這些問題的出現[8]。

3 行為影響

多個研究發現IVF操作與小鼠的行為和焦慮水平相關[9-10]。研究人員起初發現IVF操作會引起后代的行為學異常[9, 11]，這些研究表明IVF出生的小鼠分窩前行為學表型較少改變，但是成年后在焦慮、自主運動、空間和內隱記憶等方面改變明顯。例如，IVF小鼠在高架十字迷宮的開放臂中停留更多的時間，表明其焦慮水平降低，這一行為差異在雄性小鼠中尤為明顯，并伴隨在焦慮相關的皮質和皮質下結構以及小腦中的單胺氧化酶A基因、促皮質素釋放因子和γ-丁胺酸表達改變[10]，這三個基因已被證明是焦慮和恐懼行為的調控因子[12]，它們與其相關受體和轉運蛋白的改變與焦慮水平的變化相關[13]。

4 器官與組織代謝

4.1 肝臟

ART小鼠老年時期的肝臟重量顯著增加，且添加了胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的培養液體外培養過的雌鼠肝臟脂肪變性，雄性和對照很少出現脂肪變性[9]。研究發現了膽汁酸代謝、蛋白質泛素化、線粒體功能障礙和氧化磷酸化的變化轉錄證據，以及可能反映細胞對治療反應差異的基因錯誤表達[14]。代謝組學數據顯示了改變蛋白水解作用和蛋白質泛素化證據——二肽濃度顯著增加，活化蛋白激酶的變化，三磷酸腺苷和三磷酸鳥苷-需能反應(增加嘌呤代謝物如腺苷酸、鳥苷酸和鳥苷)和減少膽汁酸儲存量。損害膽汁酸的合成以致膽汁酸儲存量減少，最終明顯減少能量消耗，導致肥胖和糖尿病的發生[9, 15]。此外，研究還發現IVF鼠的肝臟中葡萄糖代謝物的含量降低，而糖原中間體的含量增加，谷氨酰胺減少，長鏈脂肪酸減少，這反映出線粒體功能的改變。在另一項研究中，IVFKAA(使用具有氨基酸和5% O2的KSOM優化培養基)和自然懷孕胎鼠肝臟的脂類組學分析顯示增加了幾個與葡萄糖代謝及血管功能異常相關的磷脂，包括溶血磷脂酰膽堿、磷脂酸和溶血磷脂酰乙醇胺，它們可能導致IVF小鼠出生后某些可能的代謝異常[16]。

4.2 脂肪組織

IVF普遍導致胎盤脂質代謝及其代謝調控網絡基因表達異常，IVF所致的與脂質代謝相關的印記基因印記紊亂以及印記維持關鍵基因表達水平異常可追溯到植入前胚胎。植入前期是重新編碼的時期，可能容易受到破壞。有研究發現IVF出生的小鼠早期生理表型正常，但是成年后會出現脂肪組織顯著增加。研究表明IVFKAA雌鼠成年后更容易脂肪沉積[15]。轉錄發生變化的基因多與脂類代謝、能量生成(如糖異生、三羧酸循環)以及胰島素受體信號通路、白介素-1信號通路和類視黃醇X受體/肝X受體和類視黃醇X受體/法尼酯X受體的異二聚體的激活相關。雄性和雌性性腺脂肪的代謝組學研究發現與脂肪生成有關的促炎性和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)代謝產物雌性特異地增加[17-19]。

脂肪是代謝異常的主要驅動，所以IVF小鼠脂肪組織性別差異可能導致性別特異的代謝表型。兩種性別的IVFKAA小鼠皆保有脂肪特有的存在，與其他成年組織相比，IVF囊胚中的轉錄變化，包括糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)和硫氧環蛋白相互作用蛋白增加[20]。這些數據提示脂肪組織可能是IVF小鼠性別和組織特異性變化的作用場所。

4.3 胰島

IVF小鼠成年期通常有較高的空腹血糖并伴有葡萄糖不耐受[14]，IVFKAA動物表現出低胰島素生成指數(葡萄糖耐量試驗中前30 min的血漿胰島素水平變化除以葡萄糖水平變化)[21]，表明由于β細胞對葡萄糖不敏感，IVF小鼠應對葡萄糖分泌胰島素的能力降低[5]。進一步的研究表明，與對照組相比，IVF雌鼠在29周的時間內體重標準化的胰腺重量較低。與其他胰島素敏感組織相比，胰島的芯片分析在基因表達上的變化更少，最顯著的變化是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表達的顯著下調，GAPDH的減少、ROS的增加是糖尿病周圍組織和β細胞引起細胞損傷的關鍵通路[22]。β細胞功能障礙隨年齡的增加而增加，有研究表明12周齡的IVF雌鼠在葡萄糖刺激下胰島素分泌正常，但是29周時，IVF小鼠胰島表現出基礎胰島素分泌增加，并且應對高糖刺激引起的胰島素分泌增加不明顯[21]。ART小鼠出生后葡萄糖體內平衡可能具有性別二態性[22]。有研究對斷奶后IVF小鼠高脂喂養8周，發現它們空腹血糖水平升高，葡萄糖耐量受損以及胰島素刺激引起的Akt磷酸化減少[23]。

4.4 血管組織

Rexhaj等發現IVF出生的FVB雄鼠脈管系統的內皮功能紊亂、硬度增加，伴隨雄性隔代遺傳的動脈高血壓[8]。血管表型能夠跨代遺傳顯示表觀遺傳在其中發揮作用，但有待進一步證實。研究者進行了定向分析，并發現動脈中內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因啟動子甲基化改變，及血管中eNOS表達和一氧化氮(nitric oxide，NO)合成降低。另一個關于血壓的評估同樣發現IVF出生的CF1×B6D2F1雄鼠收縮壓降低、舒張壓與自然生產對照鼠一樣[5]。但是，另一個研究結果表明胚胎培養后收縮壓升高[24]。結果差異的復雜性與小鼠品系、血壓測量方法和實驗設計(例如在Rexhaj等[8]的研究中沒有對每窩的產仔數進行控制)相關。研究發現由ART產生的小鼠的脈管系統顯示內皮功能障礙和血管硬度增加，其在體內轉化為動脈高血壓。雄性ART小鼠的后代也顯示血管功能障礙，這表明ART鼠的遺傳物質受到了表觀遺傳修飾。給予ART小鼠脫乙酰酶抑制劑后血管基因甲基化和功能恢復正常，以致子代小鼠沒有血管功能障礙。ART相關血管和表觀遺傳改變的誘因似乎與胚胎環境有關，這些改變可能通過伴隨ART的激素刺激排卵來促進[8]。

小鼠在妊娠期間營養不良可通過表觀遺傳機制引起后代的肺血管功能障礙，而IVF即可能會造成小鼠胚胎早期的營養不良。在大鼠中，懷孕期間的限制性飲食(restrictive diet during pregnancy，RDP)增加了胎盤中的氧化應激。氧化物誘導表觀遺傳改變，并且可能穿過胎盤屏障，所以一項研究檢測了缺氧2周后RDP和對照小鼠后代的肺血管功能和肺DNA甲基化，發現體外內皮依賴性肺動脈血管舒張受損，體內低氧誘導的肺動脈高壓和右心室肥大在RDP后代中更加顯著。給予組蛋白脫乙酰酶抑制劑丁酸鹽和曲古抑菌素A后RDP后代的肺DNA甲基化和血管功能恢復正常。最后，在RDP期間向孕鼠施用氮氧化物tempol可防止后代的血管功能障礙和異位甲基化[25]。

4.5 心臟

與對照組相比，封閉群IVFWM雄鼠的血壓偏低，但是超聲心動圖結果顯示它們心臟收縮末期和舒張末期的體積增大[24]。超聲心動圖分析還發現IVF和胞質內精子注射的幼鼠左心室肥大[26]。另一個研究表明培養條件的差異能夠顯著影響出生后心臟重量，體外培養時加入FCS的小鼠在20月齡時心臟重量顯著增加[9]。盡管大部分心臟幾何形態參數在各個研究組中是可以比較的，IVF后代在校正了年齡、性別、體表面積和心率后，其左心室相對壁厚、左心室質量指數和左室重構指數顯著升高。

5 分子表型

許多研究小組報告了一系列與IVF和胚胎培養有關的出生后代謝和分子表型。但是考慮到小鼠品系和體外培養條件的差異，很難將多個研究聯系到一個全面的解釋，即植入前的體外暴露如何影響成年表型。有研究組采用多組學方法，因為僅芯片并不總能捕獲所有的基因轉錄本或組織/胚胎言行，代謝組學提供了細胞過程和轉錄改變潛在結果的實時概覽。芯片分析發現1361個基因錯誤表達，但是只有16個基因的表達差異在兩倍以上，其中包括Ccl7、Ccl19、Chd7、Cnnm2、Il17ra、Il1rb、Gfpt2和Ngf，主要集中在炎癥反應信號通路、細胞組裝和組織、癌癥、細胞間的信號傳遞、相互作用和運動等[27]。值得注意的是，相似的結果在自然出生和ART出生的兒童的心臟功能分析中有報道[28]。芯片研究結果顯示超過35個錯誤表達基因反映了GR信號上調，這是值得注意的，因為不適當的糖皮質激素信號可以影響生長、對慢性疾病的易感性，以及誘導應激反應。糖皮質激素的升高也與心血管疾病和糖尿病的易感有關[29]。IVF轉錄信號豐富的其他信號通路包括細胞間通信和運動，也包括NO和ROS的產生[28]。

比較E3.5、E7.5和E10.5三個重要發育階段的體內胚胎和IVF胚胎的microRNA-seq數據，發現失調的microRNAs主要參與調控與癌癥發生、遺傳信息加工、葡萄糖代謝、細胞骨架組成及神經發生等過程相關的基因，進一步發現IVF組胚胎中僅有miR-199 a-5p從E3.5到E10.5持續低表達。通過功能性缺失與補償性實驗，證實IVF引發的miR-199 a-5p低表達是造成IVF胚胎糖酵解率高、發育潛能降低、附植后胚胎存活率低的主要原因[2]。

綜上所述，ART小鼠可能在性別比例、生長發育、行為、某些器官與組織代謝以及分子等表型方面存在某些異常，對于這些異常，尤其是性別比例和生長發育相關的異常，研究結果存在一些多樣性，仍然需要更多的研究來驗證它們，以排除不同研究者觀察的IVF小鼠樣本量的大小、動物健康及飼養管理水平等非IVF因素等帶來的干擾。而且這些異常大部分出現在進行了胚胎體外操作出生的那一代小鼠，針對IVF后代可能出現的一些健康問題，仍需要大量研究探索，進而根據具體情況合理使用該技術，或者提出針對性的解決方案，最終實現ART更加安全有效的應用。盡管有一些瑕疵，但是ART技術現在并且以后仍然會在基因修飾小鼠制作、冷凍保種、生物凈化等方面對生命科學的發展發揮非常重要的作用。

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